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第一章尖锐湿疣皮损中朗格汉斯细胞免疫表型的分析背景在正常情况下,朗格汉斯细胞(Langerhans cells,LC)的数量及密度保持着平衡,LC的密度在表皮中为200个/mm~2至970个/mm~2。在感染或炎症情况下,LC的数量和密度较正常增加。而尖锐湿疣(condvloma accuminatum,CA)作为一种人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染引起的皮肤的良性肿瘤性疾病,其皮损中LC的特点尚无定论。目的了解LC在CA皮损中数量、密度、形态及功能的变化。方法采用免疫组化SP法检测30例CA皮损中朗格汉斯细胞表面标志CD1a、S-100蛋白和HLA-DR的表达,并设20例正常成人包皮作为对照,比较CA皮损中和正常成人包皮中朗格汉斯细胞的形态、数量及功能等的差异。结果1.朗格汉斯细胞计数:①CD1a+LC的表达情况及计数:CA皮损表皮中可见较多的CD1a+LC镶嵌在棘层细胞间和基底层,分布比较规则,多位于表皮中部。胞体形态不规则,部分为圆形、椭圆形,细胞突起多且细长,部分可见二级突起。对照组正常皮肤组织中CD1a+LC分布亦比较均匀,主要分布在表皮棘细胞层和基底层,LC胞体呈圆形、椭圆形或不规则形,细胞突起多且细长,部分可见二级突起。CA皮损表皮中CD1a+LC的密度为(195.23±56.38)个/mm~2和(52.63±31.29)个/1000KC(每1000个角质形成细胞),对照组正常皮肤表皮中CD1a+LC的密度为(201.71±53.69)个/mm~2和(55.91±29.64)个/1000KC,CA皮损组和对照组表皮中CD1a+LC的数目,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。②S-100+LC的表达情况及计数:CA皮损中无典型的树突状细胞,仅可见极少量表现为点状的胞突结构,部分标本无S-100+LC的表达。对照组正常皮肤组织中S-100+LC主要分布在表皮基底层以上部位,正常皮肤中典型的树突状细胞少见,LC形态呈圆形、椭圆形或点状,细胞突起短而少,甚至消失。个别标本的表皮局部S-100+LC消失。CA皮损表皮中S-100+LC的密度为(16.12±10.84)个/mm~2和(4.06±2.68)个/1000KC,对照组正常皮肤表皮中S-100+LC的密度为(62.35±33.97)个/mm~2和(14.25±5.74)个/1000KC,CA皮损组和正常皮肤组表皮中S-100+LC的数量,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。③HLA-DR+LC的表达情况及计数:CA皮损表皮中HLA-DR+LC数量较少,分布不规则,以表皮中、下部相对多见,典型的树突状细胞相对减少,有部分LC胞体变小,树突状突起变钝、缩短、减少、或消失。CA皮损组织中KC表面亦几乎没有HLA-DR抗原表达。对照组正常皮肤组织中HLA-DR+LC分布比较规则,主要分布在表皮棘细胞层和基底层,真皮浅层可见较多的树突状细胞表达,LC细胞形态与CD1a+LC相似,正常皮肤角质形成细胞表面没有或极少量的HLA-DR抗原表达。CA皮损表皮中HLA-DR+LC的密度为(125.26±25.13)个/mm~2和(32.38±13.80)个/1000KC,对照组正常皮肤表皮中HLA-DR+LC的密度为(183.66±42.22)个/mm~2和(50.91±32.57)个/1000KC;CA皮损组和对照组表皮中HLA-DR+LC的数目,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。2.免疫组化半定量分析:尖锐湿疣皮损组织CD1a免疫组化染色30例,其中阴性3例,弱阳性6例,阳性16例,强阳性5例;对照组CD1a免疫组化染色20例,其中阴性2例,弱阳性5例,阳性10例,强阳性3例。两者之间差异无统计学意义(P＞0.05);尖锐湿疣皮损组织S-100蛋白免疫组化染色30例,其中阴性16例,弱阳性15例,阳性和强阳性均无;对照组S-100蛋白免疫组化染色20例,其中阴性3例,弱阳性14例,阳性3例,强阳性0例。两者之间差异有统计学意义(P＜0.05);尖锐湿疣皮损组织HLA-DR免疫组化染色30例,其中阴性8例,弱阳性16例,阳性6例,强阳性0例;对照组HLA-DR免疫组化染色20例,其中阴性3例,弱阳性6例,阳性9例,强阳性2例。两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。3.免疫组化定量分析结果显示:尖锐湿疣皮损组织阳性细胞CD1a的图象灰度值与对照组正常皮肤比较无统计学差异(P＞0.05),即尖锐湿疣皮损组织CD1a+LC的表达与正常皮肤无差异。尖锐湿疣皮损组织阳性细胞S-100蛋白、HLA-DR平均灰度值高于正常皮肤(P＜0.05),即尖锐湿疣皮损组织中S-100+LC和HLA-DR+LC的表达低于正常皮肤。4.S-100+LC/CD1a+LC比例的分析结果显示:30例CA皮损表皮中S-100+LC平均密度约为15.25个/mm~2,CD1a+LC平均密度约为195.23个/mm~2,S-100+LC/CD1a+LC比值为7.30%;对照组表皮中S-100+LC平均密度约为62.35个/mm~2,CD1a+LC平均密度约为201.71个/mm~2,S-100+LC/CD1a+LC比值为30.91%,CA皮损和对照组表皮中S-100+LC/CD1a+LC的比值,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)5.应用SPSS12.0统计软件对CA皮损表皮中表达的CD1a+LC、S-100+LC、HLA-DR+LC的平均灰度值两两之间进行直线相关性分析,结果显示CA皮损表皮中表达的CD1a+LC、HLA-DR+LC的平均灰度值,相关系数r=0.5728,P＜0.05,两者之间呈直线相关关系;CD1a+LC、S-100+LC的平均灰度值,相关系数r=0.0961,P＞0.05,两者之间无直线相关关系;S-100+LC、HLA-DR+LC的平均灰度值,相关系数r=0.0392,P＞0.05,两者之间无直线相关关系。结论初发CA皮损中LC细胞数量、形态接近正常,90%以上处于未成熟状态,表明LC存在明显的功能成熟障碍,参与激活T细胞的功能受限。第二章MCP-1mRNA及其蛋白在尖锐湿疣皮损中表达的研究背景外周血单核细胞是LC的前体细胞,能影响免疫细胞包括单核细胞等迁移的主要是趋化因子,在皮损局部,角质形成细胞是这些因子的重要来源。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是趋化LC的主要趋化因子之一,但是否由于CA皮损中角质形成细胞所产生MCP-1异常导致CA皮损中LC的异常尚不清楚。目的从mRNA和蛋白水平检测CA皮损中MCP-1的表达,探讨MCP-1在CA皮损中LC异常机制中的作用。方法采用原位杂交、免疫组化技术和Western Blot的方法,分别检测30例尖锐湿疣患者皮损及20例正常皮肤组织标本中MCP-1mRNA及其蛋白水平的表达情况。结果1.原位杂交结果显示:MCP-1 mRNA主要定位于细胞浆,呈黄色,棕黄色或棕褐色颗粒状,偶见于细胞核。正常皮肤中可见到表皮角质形成细胞胞浆MCP-1mRNA呈阳性表达,但阳性信号极微弱,其中杂交信号以基底层最为明显。尖锐湿疣皮损中几乎无MCP-1mRNA杂交信号。与正常皮肤相比,两者差异无统计学意义(P＞0.05)。2.免疫组化结果显示:MCP-1蛋白主要定位于角质形成细胞胞浆,呈黄色,棕黄色或棕褐色颗粒状,偶见于细胞膜。MCP-1在正常皮肤有极弱的阳性表达,表皮层以基底层为主,另外,在正常人皮脂腺及汗腺组织中,偶可见到阳性表达。尖锐湿疣皮损中无MCP-1蛋白的表达或极弱的阳性表达。与正常皮肤相比,两者差异无统计学意义(P＞0.05)。3.Western Blot检测结果显示,在尖锐湿疣皮损和正常皮肤组织中表达的MCP-1蛋白极低,两者差异无统计学意义(P＞0.05)。结论在CA皮损角质形成细胞中MCP-1表达微弱,不能趋化足够的单核细胞转化为CA皮损中的LC,导致成熟期LC的生成不足,不能引起相应的炎症反应以及免疫应答。第三章结合珠蛋白mRNA及其蛋白在尖锐湿疣皮损中表达的研究背景CA皮损中LC并不存在数量和形态上的缺陷,但缺乏成熟S-100+DC表达,提示LC存在功能成熟障碍,原因可能是由于某些细胞因子的异常导致尽管HPV抗原的刺激仍然不能诱导LC分化为成熟的DC,我们选择对LC功能成熟具有抑制作用的结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)作为研究的切入点探讨LC异常的机制。目的从mRNA和蛋白水平检测CA皮损中Hp的表达,探讨Hp在CA皮损中LC异常机制中的作用。方法采用原位杂交、免疫组化技术和Western Blot的方法,检测30例尖锐湿疣患者皮损及20例正常皮肤组织标本中HpmRNA及其蛋白的表达情况。结果1.原位杂交结果显示,正常人皮肤中可见到角质形成细胞胞浆Hp mRNA呈弱阳性表达,染色强度以表皮基底层、棘层较为明显。Hp mRNA主要表达于尖锐湿疣皮损的角质形成细胞,与正常皮肤相比,Hp mRNA在尖锐湿疣皮损的表达部位基本一致,表达明显增强,尖锐湿疣皮损Hp mRNA的平均灰度值低于正常皮肤对照组(P＜0.05),尖锐湿疣组与正常皮肤对照组角质形成细胞Hp mRNA表达强度差异有统计学意义(P＜0.05)。2.免疫组化检测结果显示,尖锐湿疣皮损中角质形成细胞的胞浆可见到较强的Hp蛋白的表达,Hp在CA患者皮损的表皮全层皆有表达,但以基底层和棘层下方较强。正常皮肤组织中可见Hp蛋白较弱的阳性表达,阳性细胞主要分布于表皮基底层,棘层下部也有少量表达。尖锐湿疣组Hp阳性表达率为93.3%,正常皮肤对照组为80.0%,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。Hp蛋白在尖锐湿疣皮损和正常人皮肤对照中免疫组化染色灰度平均值的比较,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。3.Western Blot检测结果显示,在正常皮肤组织中,表达的Hp较低,而在尖锐湿疣皮损的表达明显高于正常皮肤组织,两者的差异有统计学意义(P＜0.05)。结论CA皮损表皮角质形成细胞中结合珠蛋白mRNA表达增强,并能合成结合珠蛋白。CA皮损中结合珠蛋白可能通过抑制朗格汉斯细胞的功能成熟和抑制角质形成细胞的免疫活性参与尖锐湿疣的局部免疫逃逸。