小麦条锈菌候选无毒基因AvrYr26的鉴定与致病相关效应蛋白的功能分析

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由小麦条形柄锈菌Puccinia striiformis f.sp.tritici(Pst)引起的小麦条锈病是一种严重威胁我国乃至全世界小麦生产安全的病害。植物与病原物经过了长久的博弈进化出了一系列的免疫反应以及克服免疫反应的途径。在这场博弈中,最初感病的植物与病原菌的持续共同进化,植物开始从致病菌中识别化合物,从而导致寄主的抗性和病原菌的无毒性。因此,能够被植物识别的效应蛋白被称作无毒(Avr)基因,而识别这些病原菌分泌的无毒基因的植物基因被称作抗病(R)基因。同时,许多Avr蛋白也同样具有毒性的功能,能够帮助并促进病原菌在易感植物中的定植,从而使致病菌受益,这些结果表明Avr基因在某些情况下也可以作为毒性基因的存在。因此,植物病原菌分泌的效应蛋白具有无毒性与毒性两面性,既可以帮助病原菌侵染,也可能作为启动植物免疫反应的靶标。因此,研究小麦条锈菌效应蛋白的功能及其调控寄主免疫反应,有助于深入解析病原菌致病机理,并为创制新的持久抗条锈病材料提供理论依据。植物病原菌效应蛋白通过多样化的作用方式参与调控寄主的防御反应,在植物病原真菌侵染定殖过程中起到了极其重要的作用。随着研究的深入和扩展,更多的效应蛋白及其调控机理已被陆续揭示。与其他病原菌比较,锈菌的研究相对滞后,特别是效应蛋白的研究也刚刚开始。在初始阶段,重点关注小麦条锈菌中含有保守功能域的效应蛋白,有助于加速小麦条锈效应蛋白的研究,同时,随着新一代测序技术、免疫荧光技术、遗传转化技术的发展,对于这方面的研究会越来越迅速,也将更加加深对锈菌致病的机理认知。本研究针对无毒性效应蛋白(无毒基因)以及几个重要的保守的毒性效应蛋白进行了如下研究:(1)利用20株来自全国各地的小麦条锈菌的重测序,对这20株小麦条锈菌通过聚类分析以及进化分析表明,这些菌株可以明显的被分成两组,其中一组为CYR32-HB、CYR32、CYR31、G862-7、CYR20、V26-CM42-2-1、V26-CM42-2-2、V26-CM42-1-2、BHPST,另一组为CYR25、CYR29、CYR33、CYR32-HN、CYR32-GS、CYR32-SNCN-1、CYR32-SNCN-2、V26-PL17-7、V26-Qu45-1、V26-Qu45-3、V26-GN21-3-1、V26-GN21-3-5。推测不同抗病基因的选择作用以及对条锈菌的筛选作用,使得新的生理小种的出现频率不断的加快。对20个重测序菌株进行了比较基因组学分析,关联分析的方法找到了10个候选的无毒基因,同时也利用了进行的转录组项目寻找到了3个候选的无毒基因。(2)分析了小麦条锈菌中的角质酶基因家族,在鉴定出的10个角质酶基因中,Pst22751是唯一在小麦侵染初期中显著高表达的基因。Pst22751蛋白具有分泌功能的信号肽,同时缺失了信号肽的Pst22751定位在小麦原生质体和本氏烟草中的细胞质和细胞核中。此外,瞬时过表达Pst22751抑制了小麦中与PTI相关的胼胝质积累及由病菌引起的H2O2积累,并能够抑制Pst322诱导的的细胞死亡。瞬时沉默Pst22751能够促进小麦条锈菌侵染并干扰植物PR基因的表达。这是活体营养寄生菌中角质酶蛋白参与病菌致病作用的首次报道。(3)证明了富含甘氨酸和丝氨酸效应蛋白PstGSRE1-m9保守基序具有与PstGSRE1相似的功能,能够抑制BAX或者Pst322引起的细胞坏死,在小麦中过表达同样能够抑制胼胝质和H2O2的积累。同时,PstGSRE1-m9能够与TaLOL2在体内和体外相互作用,而共表达PstGSRE1-m9与TaLOL2时也干扰了的TaLOL2核定位。失去PstGSRE1-m9将会导致PstGSRE1失去功能,但是PstGSRE1-m9单独存在时功能比PstGSRE1完整蛋白功能有减弱,说明了PstGSRE1-m9之外的其他区域对PstGSRE1蛋白活性有促进作用。本研究深入解析了PstGSRE1-m9通过阻止TaLOL2进入细胞核从而调控了寄主免疫反应。(4)鉴定到一个含有HMG保守结构域的小麦条锈菌非典型效应蛋白PstHMG1。q RT-PCR分析发现,该基因在孢子萌发早期和侵染初期呈现明显的上调表达趋势,上调倍数最高为对照的744倍。进一步分析表明PstHMG1能够引起细胞坏死,同时拥有降解DNA的能力,而序列分析表明蛋白质不含有N端的信号肽序列。序列分析预测发现PstHMG1可能是一个非典型分泌蛋白。通过农杆菌注射法在烟草叶片中表达PstHMG1,3天后提取烟草叶片胞间液中检测到了PstHMG1,说明了PstHMG1确实分泌到了胞外。免疫胶体金实验分析发现,PstHMG1在菌的侵染菌丝、吸器以及小麦细胞中的叶绿体和细胞核中均有分布。HIGS瞬时沉默PstHMG1发现,沉默后小麦条锈菌生长受到了抑制,同时产孢出现了显著性降低,证实了PstHMG1在小麦条锈菌侵染过程中是一个致病因子。推测PstHMG1可能分泌到寄主体内降解寄主DNA从而促进小麦条锈菌侵染。
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