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膀胱癌是泌尿系统中的主要癌症,具有发病率高和易复发等特点。手术后进行膀胱灌注是术后防复发的重要手段,课题组合作单位研制的膀胱灌注药物“苏复宁洗液”能有效的预防膀胱癌术后复发。课题组研究发现,苏复宁洗液的主效成分巴西苏木素(Brazilin)能有效的致死膀胱癌T24细胞。但目前尚缺乏对巴西苏木素作为膀胱癌治疗药物的广谱性、安全性及其致死膀胱癌细胞的死亡机制的系统研究。在本文中我们以不同来源膀胱细胞为对象,检测巴西苏木素作为膀胱癌治疗药物的广谱性和安全性;通过检测巴西苏木素对膀胱癌T24细胞中的叠加增殖性质、乳酸脱氢酶、钙离子和线粒体膜电位等生理生化性质的影响,进一步明确巴西苏木素对膀胱癌细胞的毒性;检测不同死亡方式抑制剂对巴西苏木素致死T24细胞效应的影响,结合半胱氨酸蛋白酶(Caspase)酶活性测定及透射电镜形态学分析,证明巴西苏木素通过程序性坏死致死膀胱癌T24细胞;进一步利用巴西苏木素作用T24细胞6 h后的数字基因表达谱数据分析及RT-qPCR(Real-time qPCR),提出巴西苏木素是通过RIP1/RIP3/MLKL介导的细胞程序性坏死途径致死T24细胞。具体研究有以下四部分内容:1.利用低血清实验检测巴西苏木素对不同类型膀胱癌细胞系的影响,发现巴西苏木素能有效致死T24、5637和J82细胞,证明巴西苏木素作为膀胱癌治疗药物具备一定的广谱性。比较巴西苏木素对正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1及膀胱上皮细胞癌细胞系T24、5637的细胞毒性,发现巴西苏木素在浓度效应和时间效应方面对膀胱上皮细胞SV-HUC-1的致死效应小于膀胱癌T24细胞和5637细胞。说明巴西苏木素作为膀胱癌药物具有一定的药物安全性。2.检测巴西苏木素对膀胱癌T24细胞一些生理生化性质的影响,发现巴西苏木素能够抑制T24细胞增殖、阻碍其不断重叠生长;引起细胞膜通透性改变、促进乳酸脱氢酶释放;引起细胞内参与众多信号传导的钙离子浓度显著升高;导致参与细胞代谢的线粒体膜电位降低。进一步明确了巴西苏木素对膀胱癌细胞的毒性效应,为巴西苏木素的药物开发提供了实验依据。3.通过不同死亡方式抑制剂处理,半胱氨酸蛋白酶活性测定及形态学观察探究巴西苏木素致死T24细胞的死亡方式。研究发现凋亡抑制剂z-VAD-fmk不能抑制巴西苏木素的药性,结合半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族酶活测定,证明巴西苏木素不通过Caspase诱导的凋亡信号致死T24细胞。而自噬小体抑制剂3-MA和程序性坏死抑制剂Nec-1均能在一定程度上抑制巴西苏木素对T24细胞的致死效应。透射性电镜观察发现巴西苏木素引起T24细胞的细胞膜破裂、线粒体崩裂、细胞核弥散等程序性坏死形态学特征,这些数据表明,巴西苏木素通过诱导程序性坏死致死膀胱癌T24细胞。4.半致死浓度的巴西苏木素作用T24细胞6 h后的数字基因表达谱数据显示程序性坏死关键基因RIP1/MLKL超表达,RT-qPCR实验证明巴西苏木可诱导T24细胞中程序性坏死关键基因RIP1/RIP3/MLKL表达显著上调,初步探明巴西苏木素是通过RIP1/RIP3/MLKL介导的细胞程序性坏死途径致死T24细胞。