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研究背景脓毒症是严重创(烧)伤、休克、外科大手术后常见的并发症,来势凶险,病情演变很快,常并发多器官功能障碍综合症(MODS),有极高病死率。负氮平衡为脓毒症状态机体代谢的典型特征,占机体细胞干重50%的骨骼肌蛋白的高分解代谢是其主要原因之一。脓毒症状态下骨胳肌蛋白高分解代谢涉及一个错综复杂的代谢调控网络。泛素系统是近年来新发现的一种蛋白降解途径,在机体代谢调节中起重要作用。研究认为脓毒症大鼠骨骼肌蛋白高分解代谢与泛素-蛋白酶系统密切相关。脓毒症时机体释放多种因子(生长因子,白介素家族因子,肿瘤坏死因子等),能直接或间接诱导泛素系统激活,影响骨骼肌蛋白降解率。白介素-15(IL-15)具有广泛的生物学活性,在骨骼肌中高表达。研究表明IL-15能够明显逆转肿瘤恶病质小鼠模型骨骼肌重量下降趋势,并能够下调泛素(Ub)活性,影响蛋白质降解。目前关于IL-15对脓毒症状态下骨骼肌蛋白质分解代谢影响的研究罕见,机制尚不清楚。研究认为TNF-α能够明显增强泛素系统的表达及活性,促进骨骼肌蛋白降解。相关研究也提示IL-15和TNF-α的释放与活性存在着相互作用,IL-15对泛素-蛋白酶途径的影响可能由TNFα介导,也可能是由IL-15直接作用于泛素-蛋白酶途径,其具体作用机制有待进一步明确。研究目的基于以上研究结果,本课题试图通过动物实验,拟进一步描述、探讨脓毒症状态下机体骨骼肌蛋白降解规律、IL-15、泛素系统蛋白及基因的表达水平变化情况和互相作用机制。摸索外源性IL-15干预的最佳时间点及剂量。提出假设：外源性IL-15干预能下调机体脓毒症骨骼肌蛋白质降解率,为脓毒症高代谢恶病质的防治探索新的途径。实验方法1.用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立稳定的脓毒症大鼠模型：CLP术后观察大鼠一般生命体征参数,各脏器损伤程度,观察模型是否建立稳定。2.健康SD大鼠随机分为CLP组(A组)、假手术对照组(B组)。于观察时间点(2h、4h、8h、12h、24h)活杀大鼠离体孵育伸趾长肌,高效液相质谱法测定总蛋白(Tyr)和肌纤维蛋白(3-MH)降解率；取血液、骨骼肌和脏器,用酶联免疫吸附法(ELISA)、组织芯片免疫组织化学染色法(IH)和实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析Ub和IL一15的基因和蛋白表达变化规律。3.外源性IL-15干预的时间及剂量摸索：根据前期研究结果,选择CLP术后8小时为时间效应点。CLP术后6h(C组)、7.5h(D组)、8h(E组)外源性IL-15干预组于干预时间点大鼠尾静脉注射高纯度重组鼠IL-15(100μg／Kg),其余时间点及非干预组(F组)注射相同剂量生理盐水。于12h活杀取标本,分析指标变化。求IL-15干预的最佳时间点(TO)。4.外源性IL-15干预：脓毒症大鼠(CLP术后)分为2组,对照组(G组)在TO(CLP术后7h)尾静脉注射生理盐水；干预组(H组)大鼠在TO尾静脉注射高纯度重组IL-15,剂量为M0,分析指标差异。5.TNFα单克隆抗体干预：对照组(Ⅰ组)单纯给予外源性IL-15干预,于CLP后2h及8h予以生理盐水注射。外源性IL-15+TNFα单抗干预组(J组)：在CLP后7h尾静脉注射重组IL-15同时,于CLP后2h及8h,分两次尾静脉注射TNFα单抗(3mg／kg)。分析指标差异。实验结果及讨论：1.采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症大鼠模型。术后随时间延长,CLP组大鼠一般状态恶化,血浆中内毒素水平进行性增高。对照组参数稳定。两组比较差异显著(P<0.01)。病理光镜显示CLP术后大鼠肝脏、肾脏细胞坏死、核裂解,骨骼肌细胞断裂。2.A组脓毒症大鼠CLP术后血浆、组织内IL-15和泛素的蛋白及m RNA总体表达水平高于B组(P<0.01),均先升高后期有所下降。较之B组,A组大鼠CLP术后血清IL-15蛋白于术后8h达最高峰后下降；骨骼肌中IL-15和Ub m RNA水平于术后4h增高,12h至高峰；骨骼肌蛋白代谢率随时间延长进行性增高(P<0.01),24h达最高峰。推断CLP术后8h为有效代偿时间窗,确定为时间效应点。3.摸索性外源性IL-15干预实验中,较F组,C组、D组、E组大鼠骨骼肌代谢率降低,血清IL-15浓度升高,血清Ub浓度降低(P<0.01),推断最佳干预时间点(TO)为CLP后7h。骨骼肌肌纤维蛋白代谢率与血清IL-15浓度呈负相关(r=-0.41374,P<0.05),与Ub浓度呈正相关(r=0.76247,P<0.01)。4.外源性重组IL-15细胞因子干预实验中,较G组,H组蛋白代谢率明显降低(P<0.01),H组血浆、组织中IL-15蛋白表达升高(P<0.05)。说明IL-15能有效拮抗骨骼肌蛋白的降解效应。5.两组血浆组织中IL-15和Ub表达水平差异有显著性(P<0.01),Ⅰ组骨骼肌肌纤维蛋白代谢率较J组低(P<0.01),但是骨骼肌总蛋白代谢率无统计学差异。说明IL-15对泛素-蛋白酶途径的影响可能由TNF-α介导,但不是唯一通路。提示骨骼肌细胞存在IL-15特异受体。小结本研究建立了稳定的①脓毒症大鼠模型；②体外骨骼肌有氧孵育系统；③高效液相-质谱法检测三甲基组氨酸和酪氨酸的方法；④分析IL-15和泛素系统基因和蛋白表达的方法与条件。实验结果描述了脓毒症病理状态下,机体IL-15和泛素基因、蛋白水平的表达规律,观察到脓毒症时IL-15和Ub的表达与骨骼肌的代谢率相关。病理状态下IL-15的转录翻译被激活。通过外源性重组IL-15因子的干预,初步摸索了IL-15干预的时间点(CLP后7h)和剂量(100μg/Kg)。实验显示IL-15干预能降低脓毒症骨骼肌蛋白代谢率,推测CLP后7h为最佳干预时间点。通过TNF-a阻断剂干预,认为IL-15对Ub系统的影响可能由TNF-α介导,但不是唯一通路。在危重病状态下,内源性IL-15的合成远不能满足机体的消耗,刺激合成以及外源性的补充十分必要。