研究背景脓毒症(Sepsis)是重症医学科(Intensive care unit,ICU)的主要疾病,是机体对感染引起的全身系统性有损于机体的炎症反应。严重脓毒症的患者可以并发多脏器功能损伤(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),而并发急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是临床常见的危重情况,严重者可出现急性呼吸窘迫综合症(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)。尽管抗感染及器官功能支持治疗技术有了显著的发展,脓毒症诱导的ALI仍然是ICU临床的巨大难题。基于上述原因,对脓毒症导致ALI的研究迫在眉睫。由于从ALI发展到ARDS的时间极其短暂,且死亡率较高,其病因及发病机制错综复杂、致病环节众多,已成为ICU病人死亡的第一因素。到目前为止,脓毒症致ALI/ARDS的确切机制仍不完全清楚,临床上仍缺少有确切治疗效果的药物,因此探究和开发治疗脓毒症的有效药物具有极其重要的意义。脓毒症发生时,首先启动先天性免疫防御病原微生物入侵,Toll样受体家族(Toll like receptor,TLR)是病原体入侵的首道防线。TLR能识别外来病原体、传递下游信号、介导炎症因子的生成。其中TLR4能识别革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,触发了下游多条信号通路的激活,其中核转录因子-κB (Nuclear factor-κB, NF-κB)通路的激活最为关键,NF-κB通路一旦激活,具有调控细胞表面受体、促炎症因子和粘附分子生成的作用,如肿瘤坏死因-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-1β(Interleukin-1,IL-1β),细胞间粘附分子-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1)等。这些细胞因子能潜在的诱导多种生物学反应,如控制病原体的生长和传播,提高整个适应性免疫应答。但持续的炎症反应是有害的甚至导致机体死亡,为避免不适当的炎症反应,通过负调控机制,不同途径的清除刺激的来源,或者抑TLR/NF-κB的活化和表达,在一定程度上能起到减轻局部炎症反应的作用,可能是临床控制炎症反应的新靶点。鉴于脓毒症发病的病理生理基础为炎症反应与凝血纤溶失衡,抗凝药物作为抗炎症治疗药物发挥抗凝外的抗炎症作用已成为目前脓毒症治疗研究的热点。肝素(Unfractionated Heparin,UFH)及低分子肝素(Low Molecular Weight Heparin, LMWH)是临床上常用的抗凝药物。而且己在体外实验证明肝素及其衍生物可通过TLR4抑制炎症反应；肝素的衍生物能通过介导对TLR4-髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的途径抑制NF-κB通路,有效的抑制脂蛋白(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的巨噬细胞释放TNF-α,发挥抗凝以外的抗炎作用。低分子肝素能通过抑制NF-κB的表达,减少促炎因子的产生和释放,发挥抗炎症的作用；因LMWH比UFH分子量更小,生物利用度更高,抗凝作用更强,半衰期长,出血等副作用更少,使其在临床应用中越来越广泛,甚至有取代普通肝素的趋势。它对脓毒血症引起的急性肺损伤中有无保护作用仍不清楚,因此本研究中,我们选择LMWH作为研究对象,评估其对脓毒症诱发的ALI有无保护作用及其可能的作用机制,为LMWH在临床治疗Sepsis并发的ALI提供理论基础。我们采用最经典的盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture,CLP)来确立脓毒症的动物模型,研究低分子肝素对CLP诱导的大鼠脓毒症ALI是否具有保护性作用,并通过不同组大鼠肺组织病理学改变、肺水肿程度、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)测定,并结合TLR4-MyD88-NF-κB信号转导通路的变化,以及炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β及ICAM-1在基因及分子水平的变化,进一步阐明低分子肝素对脓毒症诱发的ALI的作用及可能的作用机制,为Sepsis急性肺损伤的临床诊治提供新的研究思路。第一章低分子肝素对脓毒症诱导的大鼠ALI的保护作用目的：评价低分子肝素对脓毒症诱导的大鼠ALI有无保护作用。方法：将雄性Wistar大鼠随机分组如下：假手术(Sham)组；CLP模型组；LMWH小剂量(75 U/Kg-1)治疗组,LMWH中剂量(150 U/Kg-1)治疗组和LMWH大剂量(300U/Kg-)治疗组；每组30只。术后观察并记录大鼠行为、生命体征、生存率等情况,于造模后6h、12h及24h收集各组支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、血清及肺组织。行动脉血气分析观察氧分压(pressure of oxygen,PO2)的变化；肺组织标本行形态学研究,通过大体标本、HE染色和Masson染色观察肺水肿、肺炎症细胞浸润、肺出血及胶原蛋白在间质沉积的情况；肺组织水肿通过组织水含量评价；通过血球计数器计数各组BALF中各炎症细胞的数量；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法测定BALF中的蛋白浓度；测定各组肺组织MPO活性,酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法测肺组织ICAM-1水平,放射免疫法测定血中TNF-α、IL-1β的含量。结果：1.LMWH对大鼠一般状况的影响：脓毒症大鼠CLP术后4h开始出现弓背、活动减少,进食量减少,精神萎靡等表现,6h后大鼠出现呼吸急促,约120-150次/min,部分存在咳嗽、弓背、前肢缩抬现象,12h后呼吸急促进行性加重,约200-250次/min,口唇、耳梢及四肢末梢可见发绀,皮毛失光泽、立毛,随病情进展严重者可出现呼吸节律不规则,俯伏不动等表现。解剖腹腔示：腹腔出血倾向明显,近段肠管扩张,被结扎的盲肠颜色灰暗,肝肿大、肺充血明显,部分大鼠存在肠系膜粘连、血性腹水并伴恶臭；低分子肝素不同剂量治疗组大鼠呼吸急促及活动情况均较CLP组明显减轻；解剖腹部可见肝脏轻度肿大,肺轻度充血,HLMWH治疗组出血倾向明显；Sham组没有相关表现。2.各组大鼠呼吸频率变化：①造模后,CLP组与同时间点Sham组相比,大鼠的呼吸频率逐渐升高,组问差异有显著统计学意义(P<0.01)；CLP组组内12h到24h时大鼠呼吸窘迫最明显,12h时、24h时较6h时大鼠呼吸频率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),但CLP组12h时与24h时无明显统计学意义(P>0.05)；②经治疗后,LLMWH治疗组的大鼠呼吸频率与CLP组相比,在各时间点均无统计学差异(P>0.05)；而其余两组治疗组仅在12h时和24h时,与CLP组大鼠相比,呼吸频率均下降,组间差异有统计学意义(P<0.05)；③同时间点内,LMWH治疗组不同剂量组问相比,大鼠呼吸频率无统计学差异(P>0.05)；3.各组大鼠不同时间点PO2变化：①造模后,CLP组与同时间点Sham组相比,大鼠的血气P02明显下降,组间差异有统计学意义(P<0.01)；其中CLP组组内12h时P02下降最低,12h较6h时PO2减低,组内差异有统计学意义(P<0.05)；12h时与24h时P02相比,无统计学意义(P>0.05)；6h时与24h时P02相比,无统计学意义(P>0.05)；②经治疗后,MLMWH治疗组、HLMWH治疗组与CLP组相比,PO2在各个时问点均升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中12h时,差异有显著统计学意义(P<0.01)；LLMWH治疗组在12h时,较CLP组大鼠的PO2升高,有统计学意义(P<0.05),6h和24h时与CLP组相比,PO2无统计学差异(P>0.05)；4.肺组织病理学变化：4.124h时大体观察：Sham组大鼠肺脏表面红润,包膜弹性好,无出血及渗血,肺切面无血性泡沫样液体及凝血溢出。CLP组肺脏表面苍白,充血水肿明显,包膜下可见较多点、片状淤血,部分大鼠肺脏表面可见重力依赖性肺水肿,并有较多泡沫样液体沿支气管断面溢出；LLMWH和MLMWH治疗组肺脏表面呈粉红色,水肿较CLP组明显减轻,气管切口可见少量血性液体溢出；HLMWH台疗组部分大鼠肺脏水肿减轻,部分大鼠肺表面可见弥漫性出血点。4.2光学显微镜下改变：HE染色可观察到正常组大鼠肺组织结构较清晰、完整,肺泡壁薄,炎性细胞无渗出,而CLP模型组大鼠肺组织可观察到肺泡壁增厚,中性粒细胞渗出,少量红细胞渗出,富含蛋白质的水肿液渗出,透明膜形成以及上皮细胞脱落。3个治疗组镜下可见：部分肺小叶的结构清晰,肺泡腔内有少量渗出,肺泡壁略增厚,肺泡问质炎症细胞的浸润减少,肺泡腔出血和渗出明显减少,气管上皮细胞接近完整。4.3 Masson染色可观察到造模后24h时Sham组可见极少量绿染的胶原蛋白沉积,而CLP组可观察到肺问质中大量绿染的胶原蛋白沉积,3个LMWH治疗组绿染的胶原蛋白沉积介于Sham组和CLP组之间。5.各组大鼠的肺水含量(W/D)变化：①CLP模型组与同时间点Sham组相比,大鼠的肺水含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；且CLP组组内在12h时肺水肿程度较6小时及24h时明显增高,组内差异有统计学意义(P<0.01)；②经治疗后,MLMWH治疗组在各个时间点与CLP组相比,W/D均下降,差异有统计学意义(P<0.05)；LLMWH治疗组及HLMWH治疗组仅在6h及24h时,肺水含量较CLP组下降有统计学意义(P<0.05)；③同时间点内,LMWH治疗组不同剂量组间相比,大鼠W/D无统计学差异(P>0.05)。6. BALF中各炎症细胞计数：6.1 BALF中白细胞总数计数：①CLP组与同时间点Sham组相比,BALF中白细胞总数明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；CLP组术后12h-24h,白细胞总数升高至最高,12时及24h时均较6h时升高,有显著统计学意义(P<0.01),24h与12h时相比,BALF中白细胞总数呈下降趋势,有统计学意义(P>0.05)；②经治疗后,6h时,HLMWH治疗组BALF中白细胞计数较CLP组下降有统计学意义(P<0.05)；12h及24h时,3个治疗组较CLP组白细胞计数明显下降,有统计学意义(P<0.01)；③同时间点内,LMWH治疗组不同剂量组间相比,无统计学差异(P>0.05)。6.2 BALF中中性粒细胞计数：①与同时间点Sham组相比,其余四组在CLP术后各时间点,中性粒细胞计数明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)；至12h时升至最高,12h时均高于6h及24h时中性粒细胞数目,差异有统计学意义(P<0.01)；24h时中性粒细胞计数仍明显高于6h时,差异有显著统计学意义(P<0.01)；②经治疗后,6h时,HLMWH治疗组BALF中中性粒细胞计数较CLP组下降有统计学意义(P<0.01)；12h及24h时,3个治疗组较CLP组中性粒细胞计数明显下降,有统计学意义(P<0.01)；③同时间点内,LMWH治疗组不同剂量组组间相比,无统计学差异(P>0.05)。7.各组大鼠不同时间点肺组织MPO活性的变化：①造模后,CLP组与同时间点Sham组相比,MPO活性均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；CLP组在12h时,肺组织MPO活性达到最高,12h与6h组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；12h与24h相比,6h与24h相比,均无统计学差异(P>0.05)；②经过治疗,6h时HLMWH治疗组大鼠MPO活性与CLP组相比,肺组织中MPO活性下降,差异有统计学意义(P<0.05)；12h时,3组治疗组大鼠的肺组织MPO活性均下降,差异有统计学意义(P<0.05),其中MLMWH组和HLMWH组下降显著(P<0.01)；24h时,三组治疗组与CLP组肺组织MPO活性相比,差异无统计学意义(P>0.05)；③同时间点内,LMWH治疗组不同剂量组组间相比,在12h时,MLMWH组及HLMWH组肺组织MPO活性较LLMWH组下降,组间差异有统计学意义(P<0.05)；6h及24h时,三组之间肺组织MPO活性无统计学差异(P>0.05)；8.各组大鼠BALF中蛋白含量的变化：①CLP模型组大鼠的BALF中蛋白含量与同时间点Sham组相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；CLP组组内在12h-24h时,BALF中蛋白量达到最高,12h及24h时较6小时时BALF中蛋白量显著增高,组内差异有统计学意义(P<0.01)；12h时与24h时相比,组内差异无统计学意义(P>0.05)；②经治疗后,3组治疗组大鼠BALF中蛋白含量与同时间点的CLP组相比均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)；6h时,三组治疗组与Sham组大鼠相比,BALF中蛋白含量无统计学差异(P>0.05)；在12h和24h时,三组治疗组与Sham组同时间点大鼠相比,BALF中蛋白含量仍增高,差异有统计学意义(P<0.05)。9.各组大鼠不同时间点血中炎症因子的变化：9.1各组大鼠血中不同时间点TNF-α(fmol/ml)的水平变化：①造模后,CLP组与同时间点Sham组相比,血中TNF-α明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；CLP组组内在12h时达到最高,24h时有降低趋势,12h时及24h时血TNF-α含量较6h时明显增高,组内差异有统计学意义(P<0.01)；24h时血TNF-α含量较12h时降低,有统计学意义(P<0.05)；②经治疗后,3组治疗组血TNF-α较CLP组有不同程度减低；12h及24h时,3组治疗组大鼠 TNF-α与CLP组相比明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)；6h时HLMWH治疗组与CLP组相比,血中TNF-α明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),LLMWH治疗组、MLMWH治疗组与CLP组相比无统计学差异(P>0.05)。9。2各组大鼠血中不同时间点IL-1β(ng/ml)的水平变化：①造模后,CLP组与同时间点Sham组相比,血中IL-1p明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；CLP组术后12h-24h时血IL-1p达到最高,12h时及24h时血IL-1p含量较6h时明显增高,组内差异有统计学意义(P<0.01)；②经治疗后,在6h及12h时,3个不同剂量LMWH治疗组与CLP组相比,血IL-1β含量均明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)；治疗后24h时,MLMWH治疗组与CLP组相比,血IL-1β含量下降有显著统计学意义(P<0.01),HLMWH治疗组与CLP组相比,有统计学意义(P<0.05),HLMWH治疗组与CLP组无统计学差异(P>0.05)；3.10各组大鼠不同时间点肺组织中ICAM-1的变化：①与同时间点Sham组相比,CLP组大鼠肺组织中ICAM-1的含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；CLP组组内12h时肺组织中ICAM-1达到最高,12h时较6h时ICAM-1的含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；24h时较6h时ICAM-1含量增高,组内差异有统计学意义(P<0.05)；24h与12h时相比,ICAM-1含量无统计学差异(P>0.05)；②经治疗后, LLMWH治疗组与CLP组相比,在6h及12h时大鼠肺组织ICAM-1含量下降,差异有统计学意义(P<0.05)；MLMWH治疗组与CLP组相比,在各个时间点大鼠肺组织ICAM-1均下降,差异有统计学意义(P<0.05),其中24h时差异有显著统计学意义(P<0.01)；HLMWH治疗组与CLP组相比,在各个时间点大鼠肺组织ICAM-1均下降,差异有统计学意义(P<0.05),其中12h时差异有显著统计学意义(P<0.01)。3.11各组大鼠死亡率观察：72h内Sham组大鼠无死亡,CLP组死亡率为55%；不同剂量LMWH治疗组能有效降低ALI大鼠的死亡率,其中LLMWH治疗组72h死亡率为40%,MLMWH治疗组72h死亡率为25%,HLMWH治疗组72h死亡率为35%。描绘各组大鼠的生存率曲线提示,LMWH治疗组能提高ALI大鼠生存率。研究结论：1.本研究通过大鼠CLP术可以成功复制脓毒症合并AL1的病理生理过程。且发现在术后12h时CLP组肺水肿程度最高、炎症细胞浸润最重,血中及肺组织中炎症因子表达水平最高,提示ALI的损伤程度最重,可为后续研究提供理论基础。2.低分子肝素治疗组能够通过对血中’TNF-α、IL-1β和肺组织中ICAM-1水平的抑制,降低ALI的炎症程度,改善了CLP导致的微结构改变,减轻了CLP致ALI的肺水肿,改善了肺部气体交换功能,起到了肺保护功能。3.中剂量低分子肝素治疗组(150IU/Kg-1)远期效果优于高、低剂量治疗组,改善AL1大鼠的生存率最明显。第二章LMWH对CLP诱导的大鼠脓毒症ALI模型的保护机制研究目的：评估LMWH对CLP诱导的大鼠AL1的保护作用机制是否是通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号通路发挥抗炎症的效果。方法：参考本实验第一部分,所有大鼠随机分为3组,每组20只：Sham组,CLP组和CLP+LMWH治疗组(150 U/Kg-1)。造模后12h收集血液和肺组织,肺组织标本行形态学研究,肺组织中ICAM-1的表达采用ELISA法检测,血中炎症因子TNF-α及IL-1β的检测采用放射免疫法,Western-Blot法测定肺组织中肺组织中TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的相关蛋白的表达,定量反转录聚合酶连锁反应(quantificational reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)法测定肺组织中TNF-α、IL-1β和ICAM-1 mRNA的表达。结果：1.肺组织病理学变化：假手术组支气管粘膜上皮完整,肺泡腔干净,肺小叶结构清晰,肺泡壁无增厚,肺泡间质内无炎性细胞浸润,纤维结缔组织无增生；CLP模型组：肺小叶结构不清,肺泡腔内有出血和渗出,肺泡壁增厚,肺泡间质内可见炎性细胞浸润,纤维结缔组织增生,支气管粘膜上皮不完整。CLP+LMWH治疗组：肺泡腔有少量出血和渗出,气管上皮细胞接近完整,部分肺小叶结构清晰,肺泡壁轻度增厚,肺泡间质中炎症细胞的浸润减少,检测到少量增生的纤维结缔组织。2.血浆中细胞因子TNF-α, IL-1β和IL-6的表达：CLP组血浆中细胞因子TNF-α,IL-1p和IL-6的表达明显高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05),而在CLP+LMWH组炎症因子的表达明显低于CLP组,差异有统计学意义(P<0.05)。3. ICAM-1的检测：与CLP模型组相比,ICAM-1的水平显著高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05), 而与CLP组相比,ICAM-1在CLP+LMWH组的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.血浆中细胞因子TNF-α, IL-1β的表达：CLP组血浆中细胞因子TNF-α, IL-1β和IL-6的表达显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05),而在LMWH组明显低于CLP组,差异有统计学意义(P<0.05)。5. ICAM-1的检测：CLP组ICAM-1的水平明显高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05),而与CLP组相比,ICAM-1在LMWH组的表达明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。6.肺组织中炎症相关蛋白的表达水平：6.1 TLRs信号通路相关蛋白表达：①TLR-4蛋白水平：CLP组大鼠肺组织TLR-4蛋白水平较Sham组升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)；LMWH治疗组较CLP组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；②MyD88蛋白水平：CLP组大鼠肺组织MyD88蛋白水平较Sham组升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)；LMWH治疗组较CLP组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；(见图3-3)6.2 NF-κB信号通路相关蛋白表达：①NF-κB通路调节蛋白的表达：CLP组大鼠肺组织IKKα、IKKβ和：IκBα蛋白水平均较Sham组升高,组问差异有统计学意义(P<0.05)；LMWH治疗组较CLP组明显降低(P<0.05),差异有统计学意义；②NF-κB蛋白在CLP组的表达显著高于Sham组和CLP+LMWH组,差异有统计学意义(P<0.05)。7.肺组织IL-1βmRNA、TNF-α mRNA和ICAM-1mRNA的表达：CLP组大鼠肺组织IL-1βmRNA、TNF-α mRNA和ICAM-1mRNA表达明显增高(P<0.05),LMWH治疗组大鼠肺组织IL-1βmRNA、TNF-α mRNA和HCAM-1mRNA表达明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：LMWH对CLP诱导的大鼠AL1的保护作用可能与抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的活化,下调炎症因子的基因转录,减少炎症因子的生成有关。