小麦黄花叶病毒致病性分化及CI基因序列分析与原核表达

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利用小麦黄花叶病毒(WYMV)提纯病毒作为抗原,免疫豚鼠制备特异性的WYMV豚鼠抗血清,采用微量沉淀法及免疫双扩散测定其效价为2<7>.建立了以豚鼠抗血清为诱捕抗体、以兔抗血清为检测抗体的异种动物双抗夹心法检测WYMV的实验方法.选择有代表性的小麦品种或育种材料26份,并从日本和美国收集到用于区分株系材料6份,在河南潢川、湖北罗田、四川雅安、江苏扬州四地进行致病性分化田间试验,根据品种的反应,并结合ELISA、RT-PCR、Western-blotting等方法进行致病性分化检测.通过RT-PCR,获得了WYMV湖北罗田分离物细胞质内含体蛋白(CI,cylindrical inclusion protein gene)基因的cDNA克隆.将含有WYMV CI基因的重组质粒经NdeI和EcoRI酶切、克隆到pET-28a(+)上,构建了原核表达载体pETCIb,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后表达出37kDa蛋白.纯化表达产物后,免疫家兔制备抗血清.经SDS-PAGE和Western-blotting分析,获得了WYMV CI蛋白的专化性抗血清.
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