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背景:小檗碱（Berberine,BBR）是从黄连等植物根茎中提取的异喹啉类生物碱,临床常与其他药合用治疗糖尿病、高血脂、高血压、肿瘤等疾病;CYP450和UGTs分别是参与人体I相和II相药物代谢的重要酶家族。业已证实,BBR在体内经CYP450代谢,主要代谢产物小檗红碱（Berberrubine,BRB）、去亚甲基小檗碱（Demethylberberine,DEB）等均具备药理活性;BBR及其CYP450代谢物,在UGTs作用下形成葡萄糖醛酸结合物后方可被清除。诸多资料显示,诱导或抑制UGTs的此类清除作用可导致临床上发生药物相互作用;关于BBR和小檗红碱下调UGTs的基因表达亦见报道。提示,BBR及其代谢物可能是UGTs的底物,或许诱导或抑制UGTs而介导药物的代谢性相互作用。然而,关于BBR及CYP450的主要代谢产物,对UGTs的影响及潜在的药物相互作用风险迄今尚无研究涉足。因此,有必要关注BBR及其CYP450代谢物小檗红碱、去亚甲基小檗碱对UGTs活性的影响及其作用机制,预测合用BBR而产生的药物相互作用的潜在风险,这对于临床合理用药,减少用药风险具有十分重要的意义。目的:通过重组UGTs酶和人混合HLMs体外孵育模型,系统研究小檗碱及CYP450代谢物（小檗红碱、去亚甲基小檗碱）对12种常见人UGTs的抑制作用,探讨其作用机制;继而以体内-体外药物相互作用外推模型,来预测其在临床上可能发生的基于UGTs酶介导的药物-药物相互作用潜在风险。方法:1.BBR、BRB、DEB的对12种UGTs酶抑制作用筛选采用12种常见的参与体外代谢的人源UGTs重组酶（UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B15、UGT2B17）,分别对BBR、BER、DEB进行体外温孵,以4-甲基伞形酮（4-MU）作为广谱探针底物（除UGT1A4采用三氟拉嗪作为探针底物）,分别在各反应体系中加入浓度为0、10、100μM的BBR、BRB、DEB,应用LC-LC/MS检测分析,探究各UGTs亚型对BBR、BRB、DEB在体外的葡萄糖醛酸化代谢情况,筛选出对BBR、BRB、DEB有显著影响作用的UGTs酶亚型。2.BBR、BRB、DEB对体外表达UGT1A1的抑制作用通过BBR、BRB、DEB对12种UGTs体外代谢的初筛结果,根据底物的Km值选取合适的底物浓度,并在该底物浓度下,合理设计如下药物浓度:0、1、3、9、18、36、72、100μM作为抑制剂浓度,在体外模拟BBR、BRB、DEB的葡萄糖醛酸化反应,分别求算药物对该酶的IC50值。3.BBR、BRB、DEB对UGT1A1的酶动力学特征的评估在上述测定的IC50值附近,选取4个浓度点作为抑制剂浓度,并根据所选底物的Km值,合理选取4个点作为底物浓度,分别在pHLMs和重组UGTs酶温孵体系中进行BBR、BRB、DEB的葡萄糖醛酸化反应,通过Graphpad prism软件作图分析,计算相应的动力学参数Ki值,探讨其酶动力学抑制作用类型。4.BBR、BRB、DEB诱发药物相互作用的预测通过前期BBR及CYP450代谢物对UGTs酶的抑制动力学研究,参考已发表文献所获得的体内血药浓度,运用经典的代谢性药物-药物相互作用推算模型,对BBR、BRB、DEB在临床上可能发生基于UGTs酶表达抑制所介导的药物相互作用风险进行预测评估。结果:1.BBR、BRB、DEB对12种UGTs酶的抑制作用在0,10,100μM的浓度下,BBR、BRB、DEB对12种UGTs酶均有一定的抑制作用,当药物浓度为100μM时,BBR、BRB、DEB抑制UGT1A1酶的剩余活性分别为27%、15%、29%,而除UGT1A1以外的其他11种酶亚型的抑制效率很弱,其剩余活性均大于50%（当BBR、BRB、DEB浓度均在0-100μM范围内）。2.BBR、BRB、DEB对体外表达的UGT1A1的抑制效应BBR、BRB、DEB对UGT1A1代谢4-MU-O葡萄糖醛酸化反应的IC50值分别为12.44±0.072μM、6.239±0.05μM、15.00±0.62μM。BBR、BRB、DEB对UGT1A1代谢胆红素-O-葡萄糖醛酸化反应的IC50值分别为13.16±0.59μM、5.764±0.73μM、16.04±0.36μM。BBR主要的CYP450代谢物BRB对UGT1A1显示出较强的抑制（IC50<10μM）,其IC50值约为原型药BBR的0.5倍,0.44倍。3.BBR、BRB、DEB对UGT1A1的酶动力学Ki值及抑制作用性质3.1 BBR对UGT1A1介导的4-MU代谢呈现混合竞争性抑制,Ki值为11.334±0.146μM;BRB和DEB均呈现非竞争性抑制,Ki值分别为5.125±0.613μM、14.343±0.816μM,提示在该反应体系中,UGT1A1先与4-MU结合形成复合物,再与BRB和DEB结合阻止4-MUG的生成,从而抑制UGT1A1的酶活性。3.2 BBR对UGT1A1和HLMs介导的胆红素-O-葡萄糖醛酸化反应均呈现为混合竞争性抑制,Ki值分别为10.352±0.276μM、13.247±0.017μM;DEB则均表现为混合竞争性抑制,Ki值分别为12.025±0.131μM、16.333±0.616μM;BRB分别呈现为混合竞争性抑制和竞争性抑制,Ki值为4.681±0.746μM、6.421±0.153μM;结果说明,在rhUGT1A1和pHLMs体系中,BBR、BRB、DEB可分别与胆红素竞争UGT1A1酶的活性中心,依次排列Ki（BRB）<Ki（BBR）<Ki（DEB）可知,对UGT1A1的酶结合能力呈现为BRB>BBR>DEB,从而干扰UGT1A1与胆红素结合,使UGT1A1代谢胆红素的能力降低,产生抑制作用。4.BBR、BRB、DEB诱发药物相互作用预测结果通过体外-体内药物相互作用模型预测,BBR对UGT1A1介导的胆红素-O-葡萄糖醛酸化反应的[I]in,u/Ki为0.1133（介于0.11之间）,具有中等抑制强度,发生药物相互作用的风险一般,对HLMs介导的胆红素-O-葡萄糖醛酸化反应的[I]in,u/Ki为0.0886<0.1,提示风险很低;DEB抑制UGT1A1的[I]in,u/Ki分别为0.235,0.173（介于0.11之间）,提示发生药物相互阻作用的风险为中等强度;而作为BBR的主要代谢物BRB抑制UGT1A1的强度[I]in,u/Ki值分别为1.812,1.321（大于1）,约为BBR的[I]in,u/Ki值的14-15倍,提示BRB抑制UGT1A1发生药物相互作用的风险程度,相比于原药BBR确实高出不少。以上数据或可支持,药物及其代谢物可能在CYP450和UGTs代谢体系间发生相互作用。结论:小檗碱、小檗红碱、去亚甲基小檗碱对UGT1A1均呈浓度依赖性抑制,且以小檗红碱对UGT1A1抑制效应最强。体外-体内药物相互作用模型预测显示,小檗碱、去亚甲基小檗碱抑制UGT1A1发生药物相互作用的风险程度较小,而小檗红碱抑制UGT1A1发生药物相互作用的风险程度明显较原药小檗碱高。本研究已然表明,小檗碱与经UGT1A1代谢的药物合用时,很有可能因其CYP450代谢产物抑制UGT1A1,而诱发潜在的药物相互作用,确应引起临床联合用药的高度重视。