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目的:研究中药祛湿化瘀方防治非酒精性脂肪肝的效果及其对“FFA-ctsb-TNFa通路”的影响。方法:分两部分实验进行。第一部分:运用CCl4皮下注射4周(2次/周)复合高脂低蛋白饮食2周诱导的大鼠非酒精性脂肪肝整体动物模型,设正常组、模型组、祛湿化瘀方组及甘乐药物对照组。造模第3周开始随机分为模型组及药物组,并灌胃给药或蒸馏水。取材后观察和检测:(1)肝组织病理变化(HE染色、油红染色);(2)血清肝功能,肝组织TG、FFA含量,GGT、SOD、NOS、GSH-Px活性和抗活性氧单位及其各指标间的相关性分析;(3)肝组织ctsb、CYP2E1免疫组织化学染色;(4)血清TNF-a含量和肝组织TNF-a、P-IκB、ctsb蛋白表达。第二部分:复制长链游离脂肪酸(油酸:棕榈酸浓度为1∶0.5mM)诱导HepG2脂肪变性和TNF-a分泌模型。分别观察:(1)在FFA刺激6h、12h、18h、24h、30h各时间点收集细胞,测TG含量,确定模型时间点;(2)分别设10%、20%、30%浓度的胎牛血清组、正常大鼠血清组、药物血清组,作用于HepG224h后,取上清检测LDH活性;(3)正常组、模型组添加10%正常大鼠血清,药物组分别添加5%、10%祛湿化瘀方药物血清,孵育6h后,各组添加长链游离脂肪酸(除正常组外)刺激24h,收集标本。分别检测:①上清中ALT、LDH活性和TNF-a含量;②细胞内TG含量,脂肪油红染色,电镜超微结构脂滴变化;③细胞TNF-a、p-IκB、ctsb蛋白表达;④细胞ctsb和TNF-a基因表达;⑤免疫化学荧光观察细胞内ctsb的表达和分布。
结果:
第一部分:(1)较之正常组,模型组肝组织出现严重的大泡样脂肪变性,肝脏炎症表现明显。肝组织TG、FFA含量,GGT、NOS活性和CYP2E1表达显著升高,SOD、GSH-Px活性和抗活性氧单位显著降低。此外,肝组织ctsb、P-IκB和TNF-a蛋白表达显著升高;(2)祛湿化瘀方对模型组中升高的肝组织TG、FFA含量、GGT活性以及血清TNF-a含量、ALT活性有显著抑制作用,抑制率分别为25.9%、82.7%、75.8%、67.7%、60.4%,显著减轻炎症损伤和肝脏脂肪变性。并能显著降低NOS活性和CYP2E1表达,显著提高肝组织SOD、GSH-Px活性和抗活性氧单位。而且祛湿化瘀方组的ctsb、P-IκB和TNF-a蛋白表达显著低于模型组。而对照药甘乐无显著降低肝组织TG、FFA含量的效果,有抗肝损伤和提高抗氧化作用。
第二部分:(1)FFA刺激24h后,模型组HepG2细胞内TG含量显著升高,脂肪油红染色显示模型组胞质内广泛着色,红色脂滴大而多,电镜超微结构可见模型组细胞胞浆内有大量的大小不一的卵圆形或圆形脂滴沉积,细胞核受挤压而变形。较之正常组,模型组细胞上清TNF-a含量和LDH活性显著升高。而且细胞内ctsb、P-IκB、TNF-a的蛋白表达以及ctsb、TNF-a的mRNA表达显著升高;(2)5%、10%祛湿化瘀方药物血清组细胞内TG含量比模型组显著降低,脂滴减少,其中10%药物血清组脂滴减少更明显。而且5%、10%药物血清均能明显抑制细胞上清TNF-a含量和LDH活性。并抑制其细胞内ctsb、P-IκB、TNF-a的蛋白表达以及ctsb、TNF-a的mRNA表达。
结论:
1.祛湿化瘀方显著降低CCl4高脂低蛋白饮食诱导的脂肪肝模型大鼠肝脏脂质含量,减轻炎症损伤和肝脂肪变性,药效显著,具有明显的抗脂质过氧化作用。
2.祛湿化瘀方不仅可通过抑制FFA以减轻其下游“FFA-ctsb-TNFa”肝脂毒性通路的影响,而且对“FFA-ctsb-TNFa”通路的ctsb环节有直接干预作用。其有效抑制ctsb表达进而抑制NF-κB的活化和TNF-a的分泌,是祛湿化瘀方防治脂肪肝和脂肪性肝炎的重要机理之一。
3.成功复制FFA诱导肝细胞脂肪变性和TNF-a分泌的体外模型。
4.“湿热内蕴、瘀血阻络”是非酒精性脂肪肝(脂肪性肝炎阶段)的重要病理机制。