免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是极具潜力的抗癌药物,如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）的抗体ipilimumab和程序性死亡受体1（programmed cell death protein-1,PD-1）的抗体pembrolizumab均已临床证明有效,改变了许多癌症的治疗格局。然而,与ICIs相关的广泛免疫激活常常在治疗中引起皮疹、腹泻、肝毒性、肾毒性等多种全身免疫副作用。这些由于T细胞过度激活带来的毒性会导致自身免疫相关的不良事件（immune-related adverse events,ir AEs）的发生,从而限制了患者对ICIs的癌症免疫治疗效应（cancer immunotherapeutic effect,CITE）的受益。提高免疫检查点抑制抗体在肿瘤免疫治疗中的效果,并减少其诱发的免疫副作用,是癌症免疫治疗中的一个难题。我们假设使用双特异性抗体结构时,靶向肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）的第二抗体将引导ICIs在实体瘤中富集,从而减少免疫系统的非特异性过度活化并保持原有的、或具有额外的肿瘤杀伤效应。前梯度蛋白2（Human anterior gradient homolog 2,AGR2）是锚定于内质网中的蛋白二硫键异构酶家族成员,对细胞内蛋白质正确折叠至关重要,亦可分泌到胞外作为旁分泌信号促进细胞生长。AGR2在肺癌、卵巢癌、大肠癌、乳腺癌等多种癌症中高表达,被检测出在实体瘤的细胞外间隙和间质液中高水平存在。胞内型AGR2在蛋白折叠中起关键作用,而分泌型AGR2作为旁分泌信号促进TME的形成且富集其中,与患者预后呈负相关。我们实验室研制出一种抗AGR2的单克隆抗体18A4。18A4及其人源化形式18A4Hu均可抑制血管生成、小鼠移植瘤生长及肺转移,能在小鼠移植瘤中大量富集且无毒副作用。基于18A4Hu的治疗效果和肿瘤靶向特性,我们设计了抗AGR2/PD-1和抗AGR2/CTLA-4双特异性抗体以引导这些ICIs靶向肿瘤。我们以优化改造后的人源化单克隆抗体18A4Hu表达质粒为基础,分别在其轻链或重链后插入了设计合成的ipilimumab或pembrolizumab可变区sc Fv片段,构建了抗AGR2/PD-1和抗AGR2/CTLA-4双特异性抗体表达质粒,使用HEK293T细胞表达并用Protein G进行亲和纯化。免疫印迹和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示所构建四种抗体均成功表达,它们与各自两种靶点的结合活性使用原核表达的GST-PD-1、GST-CTLA-4及his-AGR2-Ds Red进行验证。通过肺癌细胞与腹腔免疫细胞的共培养实验,初步探究了抗AGR2/PD-1双特异性抗体的初步体外活性。本课题成功构建了靶向肿瘤微环境信号分子AGR2和免疫治疗靶标PD-1的双特异性抗体及靶向AGR2和CTLA-4的双特异性抗体,验证了其结合活性,初步在体外细胞水平显示了阻断AGR2信号网络和PD-1免疫检查点蛋白网络的影响,为研究验证抗AGR2/PD-1和抗AGR2/CTLA-4双特异性抗体的抗肿瘤活性和作用机制奠定了扎实的基础,可帮助改善抗PD-1及抗CTLA-4抗体在人体中产生广泛副作用的缺点,并对推动新型双特异性治疗抗体的研发具有重要意义。