炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）简称炭疽杆菌,是能形成芽孢的革兰氏阳性粗大杆菌。它可感染动物和人引起皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽等。炭疽病是五大人畜共患病之一,对畜牧业及人类健康的危害很大。此外,炭疽杆菌还被用作首要的生物战剂和制造生物恐怖,对社会稳定造成很大威胁。因此炭疽杆菌对人类社会的影响是极其巨大的,这使得与之相关的研究一直是生命科学领域的热点之一。目前对炭疽杆菌的研究表明,除已知的质粒上主要的毒力基因外,染色体上的一些基因也很可能与毒力相关,这些基因所表达的多种毒力相关蛋白构成了炭疽杆菌精细的毒力调控网络。当前与此相关的研究仍在探索阶段,筛选并进一步认识这些蛋白的功能将有助于加深对炭疽杆菌及其致病机理的认识。蛋白质组的研究策略和技术手段不仅是全面系统地探寻生命现象背后的奥秘的有利工具,还是后续功能研究的有效筛选方法。在本课题研究中,以比较蛋白质组的数据为切入点,从中筛选可能与炭疽杆菌的毒力发挥相关的蛋白,并重点对该蛋白进行功能研究,探寻它与毒力之间可能的关系。细菌在宿主环境中能够发挥毒性作用的前提是必须首先能够在宿主体内生存,适应环境的变化,有效利用能源,抵抗各种抗菌物质的攻击。因此,在宿主体内表达上调的蛋白可能与细菌的毒力发挥过程相关。鉴于以上分析,在本研究中用蛋白质组的手段对炭疽杆菌在体内外的蛋白表达差异进行比较。由于实验条件的限制,要在完全接近炭疽杆菌的致病状态下收集足量的蛋白样品用于蛋白质组学的研究仍存在不少困难,因此目前报道的与炭疽杆菌在宿主体内变化有关的蛋白质组研究数据都是通过体外模拟得到的。这种体外模拟缺少宿主的动态参与,所得信息与真实的感染过程仍有一定的差别。因此在本实验中,尝试通过家兔的肠结扎模型来进行炭疽杆菌的体内培养。选取对炭疽杆菌中度敏感的家兔作为实验动物,将炭疽杆菌置肠炭疽高发的回盲部培养,通过对比该状态下与体外培养的蛋白表达差异,筛选可能在细菌对宿主的适应过程中起作用的蛋白。研究中对炭疽杆菌在宿主体内外上清蛋白、细胞壁蛋白及全菌体蛋白用不同的方法进行提取,并用双向电泳的方法进行了蛋白的分离和分析,对其中丰度较高的稳定差异点进行了质谱鉴定。共送检样品144个,其中上清蛋白样品29个、细胞壁蛋白样品30个、全菌体样品85个;共检出124个,总检出率86.8%,其中上清蛋白样品19个,细胞壁蛋白样品29个,全菌体样品76个。对质谱结果进行分析发现,进入宿主体内后,细菌暂时减少了广泛的生物合成,结果中可看到合成代谢相关的蛋白主要呈下调趋势,包括多种氨基酰-tRNA合成酶、长链脂肪酸CoA连接酶等。在体内表达上调的蛋白具有多种不同的功能。其中分子伴侣DnaK、超氧化物歧化酶Sod-A等于应激相关,S-层蛋白的变化与细菌的结构有关等等。这些蛋白的变化提示了炭疽杆菌在进入宿主之后,通过下调广泛的生物合成,而将能量集中用于合成少数有助于其生存的蛋白,从而在新的环境中实现物质代谢的平衡及内环境的稳定,进而得以生存和发展。在上清蛋白样品中有一高丰度的上调点经质谱鉴定为一假想的S-层蛋白,编号BA3338,目前对其研究甚少,功能未知。相关研究表明,S-层具有保护细胞、连接细胞外酶类、分子筛和细胞黏附等作用,在病原体中还可抵抗宿主的免疫攻击,很可能是一种毒力因子。炭疽杆菌的S-层蛋白还被认为可能是重要的疫苗和药物的靶标。当前对于炭疽杆菌主要的S-层蛋白Sap和EA1的研究表明,两蛋白具有独特的表达特点,并与炭疽杆菌的毒力调控网络有关。鉴于S-层蛋白在细菌的生长中具有重要的作用,本课题的后一部分重点对BA3338进行相关功能的研究。为了探寻BA3338可能具有的功能,寻找下一步研究的线索,首先用GST pull-down技术对可能与之具有相互作用的蛋白进行初筛。分析BA3338所处的位置,认为它作为细胞壁上的蛋白,一方面可能与细菌自身的蛋白相互作用,另一方面可能与宿主的蛋白相互作用,发挥不同的功能。因此进行了BA3338与炭疽杆菌A16R蛋白以及宿主的血清蛋白与巨噬细胞蛋白的GST pull-down初筛。实验中还尝试通过对相互作用前后的洗脱液经过除盐处理后进行双向电泳的分离,通过对比得到可能的特异性结合蛋白。这种方法获得的信息更多,对差异点的判断也更准确,质谱检出率更高,更能避免高丰度蛋白的干扰。在本实验中,用这种方法对与人血清GST pull-down前后的beads洗脱液进行分离,送检11个点得到了5个可能具有特异性结合的蛋白,这在该类实验的筛选比例中是比较高的。初筛结果显示BA3338可能与炭疽杆菌的S-层蛋白Sap和EA1及宿主的纤连蛋白、IHRP、SP40/40等蛋白存在相互作用,为今后的实验方向提供了一些线索。对于BA3338与人巨噬细胞蛋白可能存在的相互作用也做了相关的探讨,但是提取的细胞蛋白量偏低,未能筛选到可疑的相互作用蛋白。初筛结果仅仅提示了一种可能性,相互作用是否真实存在仍需进一步验证,因此对GST pull-down所得的结果中Sap、EA1、FN和BA3338之间的相互作用进行验证。成功表达了带组氨酸标签的Sap和BA3338蛋白,并完成了Sap和BA3338之间的直接相互作用的验证,认为两蛋白间存在直接的相互作用。对于EA1未能有效表达,具体原因未知,还需进一步探讨。对于FN与BA3338之间相互作用的验证,使用了Far Western的方法,但由于空载体表达产物的干扰,仍需去除干扰进一步进行验证。GST pull-down初筛结果提示了BA3338可能与炭疽杆菌的感染过程有关,因此最后对BA3338的抗体是否具有一定的保护作用进行了检测。由于免疫动物时使用的是对炭疽具有一定抵抗力的大鼠,使得阴性对照亦表现出很强的杀菌能力,特异性抗体的作用不好判断。但是,实验中观察到的大鼠血清（尤其是免疫后的血清）对于炭疽杆菌繁殖体及芽孢的显著抑制作用或许值得从另外的角度进行深入研究。