背景:近年来,新型冠状病毒（SARS-Co V-2）所引发的新冠肺炎（COVID-19）疫情对全球公共卫生以及社会经济发展造成重大威胁。疫苗仍是当前防控新冠疫情的重要手段之一。新型冠状病毒具有较强的突变能力和较快的变异速度,可能造成免疫逃逸从而导致多重感染和病毒传播。研究新冠病毒的免疫生物学特性为疫苗分子设计提供一定的研究基础显得尤为重要。目的:1.疫苗分子的合理设计是成功制备疫苗的前提,本研究对SARS-Co V-2 Spike蛋白抗原表位的免疫生物学特性进行分析和表位筛选,设计基于表位的新冠疫苗分子。2.在基于表位的疫苗研发过程中,表位的鉴定也十分重要,研究中以合成肽表位为抗原鉴定表位在血清中的免疫反应性。3.在真核表达系统和原核表达系统中分别进行表位表达,建立基于融合蛋白的SARS-Co V-2线性B细胞表位鉴定方法。方法:1.通过多种免疫信息学表位预测分析工具,对S蛋白进行表位筛选并设计候选疫苗。随后,使用各种免疫信息学工具对疫苗的理化性质、致敏性、抗原性和溶解性进行评估,对疫苗分子进行二级结构、三级结构、构象B细胞表位和分子对接分析。最后,通过C-Imm Sim服务器计算机模拟免疫刺激来验证疫苗的免疫应答情况,在对疫苗基因序列进行了密码子优化后使用Snap Gene软件构建新冠疫苗原核表达载体。2.通过间接酶联免疫吸附法（ELISA）评估所选的4个中和表位合成肽（EPI-1、EPI-2、EPI-3、EPI-4）在新冠康复者和疫苗接种者血清中的免疫反应性。3.通过PCR、酶切、连接等反应构建真核表达和原核表达载体融合候选表位重组质粒,随后分别进行脂质体转染293T细胞和转化BL21（DE3）p Lys S大肠杆菌感受态细胞表达目的蛋白,并通过细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹方法验证蛋白表达结果。经鉴定双抗夹心ELISA法稳定性后初步建立基于融合蛋白的表位鉴定方法。结果:1.本研究筛选出S蛋白上具备高保守性、免疫原性且无毒的B细胞表位和T细胞（Th、CTL）表位,同时候选CTL表位和具有IL-4和IFN-γ诱导特性的Th表位均显示出MHC等位基因高人群覆盖度。使用KK、AAY、GPGPG、EAAAK linkers将候选表位和TLR4激动剂50S L7/L12分子佐剂氨基酸连接在一起得到候选疫苗。各项分析结果显示,疫苗具有抗原性、高稳定性、溶解性良好且非致敏,疫苗模型结构呈现高质量。通过分子对接实验确定了候选疫苗配体与TLR4/MD2受体相互作用的氨基酸。计算机免疫模拟刺激显示候选疫苗可以同时诱导体液和细胞免疫应答。此外,构建了新冠疫苗原核表达载体p GEX-S。2.研究表明4个中和表位在COVID-19康复者血清中均具有免疫反应性,EPI-1、EPI-2、EPI-4在康复者血清中的免疫反应性高于EPI-3。3.经实验验证目的蛋白均已表达,双抗夹心ELISA法稳定性良好。结论:本课题利用免疫信息学工具成功筛选SARS-Co V-2 Spike蛋白上的优势B细胞和T细胞表位,并设计基于表位的疫苗分子。使用间接ELISA鉴定4个合成肽中和表位在新冠感染康复者和疫苗接种者血清中的免疫反应性,该方法用于表位的免疫学鉴定是有效可行的。此外,初步建立了基于融合蛋白的表位鉴定方法,为防控新冠肺炎设计基于表位的新冠病毒疫苗提供了理论基础和数据支持。