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研究背景致心律失常性右室心肌病(Arrhythmo genic right ventricular cardiomypathy ARVC)是原发性遗传性心肌病,以右室心肌不同程度地被纤维脂肪组织代替为主要特征,往往伴有心室扩大,心力衰竭,严重恶性心律失常甚至猝死发生,是青少年及运动员猝死的主要病因。流行病学调查分析人群中发病率为1/2000-1/5000。一半以上的ARVC病例是由桥粒基因突变所引发的,最常见的桥粒基因突变为：plako globin (PG), desmoplakin (DSP), plakophilin-2 (PKP2), desmoglein-2 (DSG2) and desmocollin-2 (DSC2)。非桥粒基因突变的基因有转录因子β3 (transforming growth factor-β3TGF-β3)和连接蛋白(connexin43 Cx43)。Wnt/β-catenin 和 Hippo信号通路是与心脏发育相关的重要通路。Wnt/β-catenin信号通路调控心脏祖细胞向心肌细胞和脂肪细胞分化。研究发现通过沉默DSP基因表达,会导致PG (γ-catenin)从细胞桥粒组合中脱落,从而和β-catenin共同竞争入核,进而引起核内脂肪转化相关的转录因子PPARγ、C/EBP改变,从而促进脂肪分化.Wnt/β-catenin 和 Hippo信号通路有交互作用,两条通路中YAP, PG 及 β-catenin相互作用形成蛋白复合体。在桥粒基因PKP2突变的情况下,激活NF2引起Hippo信号通路的重要因子MST1/2, LATS1/2 及 YAP发生激酶的级联反应,通过一系列磷酸化,阻止YAP入核发挥作用,Hppo信号通路激活,发挥抑制Wnt通路作用,从而引起核内转录因子改变促进细胞脂肪化。因而,Hippo通路和Wnt通路可能共同参与了ARVC的发病。近年来研究发现,micro RN A在心血管疾病的各种病理生理过程中发挥了重要的调控作用,研究表明microRNA调控心脏的发育和功能,在许多心血管疾病如急性心肌梗死、肥厚型心肌病、心力衰竭、动脉粥样硬化等疾病中,microRNA都扮演了重要的角色。microRNA参与许多通路的调控而发挥作用,也参与了Wnt/β-catenin和Hippo信号通路调控疾病的病理生理过程。然而microRNA与ARVC的研究报道尚少,我们推测ARVC的发病过程,可能有microRNA的调控参与。研究目的探讨microRNA 与 ARVC发病机制的关系,明确microRN 在 ARVC心肌病中的表达谱及microRNA可能通过Hippo信号通路调控ARVC发病机制,为ARVC致病机制研究及临床诊断治疗提供依据和方向。研究方法和结果本研究中应用qRT-PCR检测技术S-Poly(A)P lus对24例刂ARVC患者心脏移植后的心肌组织样本microRNA进行了检测,共检测1078个人类microRNA,同时以24例正常心肌组织样本作为对照。通过检测发现24个表达异常的microRNA,并进一步在单独样品中进行了验证,结果发现有12个microRNA表达上调,11个microRNA表达下调。进一步应用ROC曲线分析,对每一个microRNA的敏感性和特异性进行分析,排除两个microRNA:miR-451a、miR-3647.应用microRNA靶基因软件进行预测显示：21个表达异常microRNA中,miR-21-5p与YAP基因的3’UTR具有潜在结合位点；miR-135b靶向MOB1b及LATS2两个基因,分析了niR-21-5p、miR-135b在Wnt、Hippo信号通路中的靶基因,并绘制了microRNA-Gene网络图。通过对ARCV心肌组织microRNA表达谱研究,发现miR-21-5p.miR-135b可能调节Vnt及Hippo信号通路,调控细胞脂肪化形成。对miR-21-5p、miR-135b的靶基因和调控机制进一步研究,在HL-1PKP2:shRNA细胞模型中检测发现miR-21-5p表达上调,而miR-135b表达下调。双荧光素酶报告系统检测结果证实miR-21-5p、miR-135b可以分别结合到靶基因mRNA的3’UTR端。在HL-1细胞中转染miR-21-5p过表达使得YAP蛋白表达受到抑制；同样过表达miR-135b时MoBlb及LATS2的蛋白表达量降低。细胞功能研究时,HL-1PKP2:shRNA细胞过表达miR-21-5p会促进细胞的脂肪分化,而miR-135b则会抑制心肌细胞脂肪分化,证实了miR-21-5p.miR-135b在Hippo信号通路中的调控功能。细胞学功能研究证实miR-21-5p促进心肌细胞脂肪形成,而miR-135b起到抑制作用。进一步研究证实YAP为miR-21-5p的靶基因,miR-135b则靶向MoBlb及LATS2.研究结论本实验应用qRT-PCR检测技术S-Poly(T)完成了ARVC患者的心肌组织microRNA表达谱研究,实验证实microRNA参与ARCV的发育和发病机制,构建了miR-21-5p、miR-135b与Wnt及Hippo信号通路的调控基因网络图。本研究明确了ARVC患者心肌组织的microRNA表达谱；并通过细胞学实验探索了两个microRNA miR-21-5p、miR-135b通过Hippo信号通路的调控基因调控基因表达而参与ARVC发病的分子机制。