目的：本实验以延边奶山羊的乳腺上皮细胞作为实验材料,确定最合适体外培养延边奶山羊乳腺上皮细胞的最佳条件,并探究延边奶山羊乳腺上皮细胞在受到外源过氧化氢给予的氧化应激刺激后,加入一定量的亚硒酸钠以发挥其对乳腺上皮细胞的保护作用,并确定亚硒酸钠对乳腺上皮细胞的最佳保护浓度。方法：(1)分别用组织块培养法和Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶消化法两种方法建立延边奶山羊乳腺上皮细胞,并对细胞进行纯化,随后对纯化后的延边奶山羊乳腺上皮细胞的骨架蛋白—角蛋白的表达情况进行检测；(2)用体外培养的延边奶山羊乳腺上皮细胞传代后进行实验。过氧化氢用DMEM/F12培养基分别稀释为5、50、100、200、500μM,以DMEM/F12培养基作为空白对照组。过氧化氢处理4h后,用MTT法观察过氧化氢对乳腺上皮细胞活力的影响,用Hoechst33342/PI荧光染色法观察过氧化氢损伤对乳腺上皮细胞的凋亡情况,DCFH-DA检测细胞内ROS含量；(3)将延边奶山羊乳腺上皮细胞分为3组：正常组(对照组1),过氧化氢损伤组(对照组2),亚硒酸钠保护组。MTT方法检测细胞活力,Hoechst33342/PI双染、Giemsa染色法检测细胞凋亡情况,DHE染色法检测细胞内ROS含量。结果：(1)使用组织块培养法5-8天后,才开始出现少量乳腺上皮细胞,呈多角形和卵圆形。而采用Ⅰ型胶原酶/透明质酸酶消化法消化收集细胞时,经3h后,消化所得到的细胞则大多为乳腺上皮细胞。利用免疫荧光染色法,结果显示,纯化后分离培养的乳腺上皮细胞角蛋白呈阳性表达,证明其具有腺泡上皮的特性；(2)MTT活性检测结果表明,各处理组的细胞存活率与未处理组存在显著差异(P<0.05)。5、50、100μM H2O2作用4h后,细胞存活率分别为：91.21%、77.50%、54.48%,而200、500μM H2O2作用4h后细胞存活率仅为35.53%、27.79%,乳腺上皮细胞死亡过多。Hoechst33342/PI染色结果表明,H2O2通过诱导乳腺上皮细胞的凋亡及坏死来降低细胞的存活率。利用荧光探针DCFH-DA分析DGMECs活性氧水平,结果显示细胞经H2O2处理后,会明显增加细胞内ROS水平；(3)较对照组2比,浓度为0.25、0.5、1.0μg/mL的亚硒酸钠保护组的延边奶山羊乳腺上皮细胞活力上升,细胞凋亡数目减少,ROS含量减少。其中以0.5μg/mL亚硒酸钠处理组效果最显著。说明0.5μg/mL的亚硒酸钠可以减少过氧化氢所致的延边奶山羊乳腺上皮细胞的氧化损伤,提高细胞活力,抑制细胞凋亡,减少细胞内ROS含量。结论：(1)使用Ⅰ型胶原酶及透明质酸酶结合的消化法进行原代培养,得到的上皮型细胞纯度相对较高,成纤维细胞混杂相对较少。经过2-3代纯化,即可得到纯化后的延边奶山羊乳腺上皮细胞；(2)用角蛋白单克隆抗体对体外培养获得的细胞进行免疫荧光鉴定,结果呈阳性,证明了其腺泡上皮的特性；(3)H202的加入导致细胞活力下降,细胞出现凋亡甚至坏死,且细胞内ROS含量上升。说明H202可以模拟体内环境,作为乳腺上皮细胞氧化损伤模型的诱导物质；(4)100μmol/LH202作用于细胞4h,导致细胞50%左右死亡,坏死比例小,ROS含量也相对较少,在此浓度下,细胞还具有恢复其功能的可能性。故选择1OOμmol/LH202作用于延边奶山羊乳腺上皮细胞处理4h,以建立氧化损伤模型。(5)0.5μg/mL SS能够提高DGMECs抵制氧化应激的能力,从而减少细胞的氧化损伤程度,提高其细胞活力；(6)通过Hoechst33342/PI及Giemsa染色结果知,SS的加入,降低了细胞的凋亡率及坏死率,故推断SS对DGMECs发挥了相应的保护机制；(7)0.5SS可以有效地降低细胞内活性氧含量,以减少ROS对细胞带来的损伤。