研究背景:卵巢癌(ovarian cancer)是女性常见的生殖系统恶性肿瘤,早期诊断困难,易发生转移,药物治疗效果差,死亡率高。因此寻求一个特异性的靶点进行早期诊断或有效治疗是目前卵巢癌研究亟待要解决的问题。对卵巢癌而言,淋巴道播散是转移的主要途径,淋巴管生成( lymphangiogenesis)促进了卵巢癌的转移浸润。而淋巴管生成主要是毛细淋巴管的形成。研究显示,肿瘤微淋巴管的形态结构与正常组织中的微淋巴管明显不同,基于这种差异,肿瘤新生淋巴管可成为肿瘤诊断与治疗中一个新的可行的靶标。但由于淋巴管内皮细胞( lymphatic endothelial cell,LEC)的取材和培养困难,一直以来对淋巴管生成的研究比较滞后。淋巴管内皮细胞是淋巴管系统最基本的组成单位,是构成淋巴管壁的主要结构。它与肿瘤扩散、炎症等病理过程关系密切。因此在研究淋巴管发育和新生的机制以及肿瘤的淋巴道转移等病理现象时,对淋巴管内皮细胞尤其是微淋巴管的内皮细胞的研究显得尤为重要。而成功分离培养淋巴管内皮细胞,则可为深入研究肿瘤淋巴管生成提供实验基础。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C和VEGF-D是最主要的淋巴管生成因子,它们通过与血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)结合,来促进实体瘤内淋巴管的新生,并促进肿瘤细胞的淋巴结转移。研究证实,VEGFR-3表达于卵巢癌新生淋巴管内皮细胞,这为以VEGFR-3为靶点进行卵巢癌淋巴管显像研究提供了可能。目前显像研究中所使用的靶向分子探针多为特异性抗体或大分子蛋白,虽然它们对肿瘤有较好的靶向性,但由于分子量大、穿透力差、血液清除慢,T/NT比较低、靶组织分布不均匀等缺点,限制了在临床的应用。与之相比,多肽分子量小、免疫原性低、血液清除快、不会被肝、网状内皮系统非特异性摄取、合成简单、易于修饰,是理想的靶向剂。而噬菌体展示肽库(Phage display peptide library)技术的完善与发展,也为开发小分子多肽提供了良好的工具。在我们的前期研究中通过噬菌体展示技术筛选获得了与VEGFR-3胞外区蛋白结合的多肽SHSWHWLP NLRHYAS。基于以上分析,并结合前期实验结果,本研究拟选择淋巴管生成作为研究靶点,通过分离培养人微淋巴管内皮细胞来探讨该多肽在体外与人微淋巴管内皮细胞表达的VEGFR-3的结合情况,再利用构建的荷人卵巢癌裸鼠模型来观察多肽靶向肿瘤淋巴管的显像情况。从面探讨以肿瘤淋巴管生成为靶标的分子显像方法,为深入进行卵巢癌淋巴管生成及转移研究提供实验基础。研究目的:通过体外分离培养人微淋巴管内皮细胞来研究VEGFR-3结合肽SHSWHWLPNLRHYAS在体外与微淋巴管内皮特异性结合及靶向卵巢癌裸鼠体内肿瘤新生淋巴管的分子显像情况。研究方法:1、分离、培养及鉴定人微淋巴管内皮细胞。无菌留取无并发症及合并症的行包皮环切术的新鲜幼儿包皮,采用组织胶原酶消化和抗体磁珠法分离人淋巴管内皮细胞(human lymphatic capillary endothelial cells,HLECs),并用细胞克隆柱进行纯化。通过倒置显微镜和透射电镜细胞的形态学观察。间接免疫荧光实验进行细胞的抗体表型鉴定。MTT法记录细胞的生长周期以及VEGF-C对细胞增殖的影响。2、VEGFR-3结合肽在体外与微淋巴管内皮细胞的结合实验。设立多肽实验组、VEFGR-3单抗阳性对照组、PBS阴性对照组,通过间接免疫荧光实验来检测多肽与体外培养的微淋巴管内皮细胞上特异性表达的VEGFR-3的结合情况。3、VEGFR-3结合肽在荷卵巢癌裸鼠体内靶向新生淋巴管的显像研究。肿瘤细胞SKOV3悬液经皮下注射法建立荷人卵巢癌裸鼠模型,等肿瘤长至1.0cm3时进行实验。用传统固相法合成多肽,再进行放射性核素99mTc标记,纸层析法测定标记率。实验组鼠尾静脉注射100ul 99mTc标记多肽(约3700 KBq 99mTc /100μg多肽),对照组注射100ul游离99mTc(约3700 KBq),用0.1%戊巴比妥钠麻醉后,在Spect仪下观察肿瘤显像情况。将实验组15只荷瘤鼠随机分为3组,分别在注射99mTc-多肽后1h、3h和6h脱颈椎处死一组小鼠,并取眼球后血、心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、后大腿骨骼、肌肉和肿瘤组织,称湿重,用γ放射免疫计数器测定各组织的放射性计数,计算每克组织百分剂量率(%ID/g)和T/NT比值。研究结果:1、原代细胞培养12-24h后,大部分细胞已经贴壁,有聚集生长的特点,形成由数个细胞组成的细胞群。倒置显微镜下见淋巴管内皮细胞呈扁平的卵圆形、短梭形或多角形,大小均匀。胞核清晰,有核的区域较无核区域突出。呈特征性“鹅卵石状”或“铺路石状”镶嵌排列生长,并有接触抑制现象。透射电镜下可见,细胞表面伸出大量的短指状突起,胞浆丰富。有的细胞内含有体积较大的空泡。细胞核大,形态各异,染色质聚集。线粒体、内质网丰富。HLECs特异性表达Padoplanin、D2-40、VEGFR-3、LYVE-1抗体。而对于血管内皮细胞(blood endothelial cells,BECs)特异性表达的VIII因子抗体,HLECs表达阴性。培养基中添加了VEGF-C的实验组细胞生长活力明显较正常组高。2、多肽组可见细胞浆呈绿色荧光,细胞核呈蓝色荧光。VEGFR-3阳性对照组,可看到细胞浆为绿色荧光,胞核区为蓝色荧光。荧光强度与多肽组相似。PBS阴性对照组,仅见细胞核区呈现蓝色荧光,细胞膜及细胞浆均未见荧光。3、实验所构建裸鼠移植瘤模型成瘤率为100%。多肽的99mTc标记率为95.27%,放射化学纯度为96%。实验组裸鼠尾静脉注射99mTc标记多肽后1 h在移植瘤部位和肾脏、肝脏、膀胱开始出现放射性聚集。其中肾脏每克组织百分剂量率最高,肺中最低,肿瘤排在第6位。在注射3 h后,各组织器官的摄取率均达到最大,其中最高为肾脏,其次为肝脏,肿瘤升至第4位,此时显像最清晰。4 h后肿瘤显像开始消褪,至6 h完全消失。这时肾脏每克组织百分剂量率仍为最高,血液中最低。游离99mTc注射组肿瘤部位始终未见显像。由此提示,99mTc标记多肽主要分布于肿瘤、肝脏及肾脏组织,在体内通过肾脏与肝脏代谢,并从血液中快速清除。肿瘤对侧肌肉组织始终呈低放射性分布,提示99mTc标记多肽可特异性在肿瘤组织部位聚集是由肿瘤组织中淋巴管内皮高表达的VEGFR-3介导的。T/NT反映肿瘤与非肿瘤组织浓聚标记物的差异,其值的高低直接影响SPECT显像效果。肝脏、肾脏的T/NT值始终较低,同样提示这些组织内的放射性计数较高,这与多肽从肾脏和肝脏代谢有关。结论:联合应用胶原酶消化、抗体磁珠分选和细胞克隆柱纯化法,成功分离培养了高纯度的人微淋巴管内皮细胞,并建立了简便、实用和稳定的细胞体外培养方法。通过培养的人微淋巴管内皮细胞,证实了结合肽SHSWHWLPNLRHYAS在体外能够识别微淋巴管内皮细胞特异性表达的VEGFR-3并与之结合,抗原结合能力强。同时该结合肽在荷瘤鼠体内能够靶向移植的人卵巢癌的新生淋巴管内皮,实现肿瘤淋巴管分子显像。因此有望成为靶向卵巢癌新生淋巴管的导向剂,为卵巢癌的诊断或治疗提供理想的靶向载体。