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第一部分淫羊藿苷ICA对RANKL诱导下RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程的ROS的影响及破骨细胞形成的影响目的:通过测定RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中ROS含量的变化以及ROS催化酶NOX1及NOX4的变化,明确ROS及NOX1、NOX4是否参与破骨细胞分化过程;通过不同浓度淫羊藿苷（Icariin,ICA）干预RAW264.7细胞在RANKL诱导下的破骨分化过程,测定ROS及NOX1、NOX4的表达量及破骨细胞生成特征性标志NFATc1及TRAP的表达变化来探讨ICA发挥破骨细胞分化抑制作用的调节方式。方法:1.RAW264.7细胞分为4组Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-8M组及RANKL+ICA 10-6M组;添加RANKL 50ng/ml。2.CCK-8法测定不同浓度ICA及RANKL对RAW264.7细胞活性的影响。3.通过DCFH-DA及DHE两种荧光探针检测Control组、RANKL组、RANKL+ICA10-8M组及RANKL+ICA 10-6M组细胞内ROS生成。4.应用实时定量PCR法（qRT-PCR）及蛋白印迹法（Western bolt）测定Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-8M组及RANKL+ICA 10-6M组在不同时间点NOX1及NOX4的表达。5.应用实时定量PCR法（qRT-PCR）及蛋白印迹法（Western bolt）测定Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-8M组及RANKL+ICA 10-6M组在不同时间点破骨细胞特征性标志-NFATc1及TRAP的表达。结果:1.CCK8测定ICA对RAW264.7细胞的细胞活性影响发现,测定发现ICA 10-8M组、ICA 10-7M组、ICA 10-6M组、ICA 10-5M组对RAW264.7细胞处理24小时,48小时,72小时后测定OD值,绘制生长曲线发现各浓度ICA对RAW264.7细胞增殖无影响。通过CCK8法测定RANKL组、RANKL+ICA 10-8M组及RANKL+ICA 10-6M组对细胞活性的影响,在CCK8加入后培养24小时后Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-8M组、RANKL+ICA 10-6M组细胞活性无差异;而48小时和72小时发现RANKL组比Control组细胞活性降低,差异有统计学意义;RANKL+ICA 10-8M组与RANKL组相比细胞活性无差异;而RANKL+ICA 10-6M组相比RANKL组活性升高,差异有统计学意义。2.RANKL诱导下的RAW264.7细胞,在培养3天后测定DCF及DHE荧光强度结果显示,RANKL组相较Control组DCF及DHE荧光强度分别提高大约3倍和2倍,差异有统计学意义。3.RANKL+ICA 10-6M组与RANKL组相比,DCF及DHE荧光强度均有所下降,差异有统计学意义。RANKL+ICA 10-8M组与RANKL组相比DCF及DHE荧光强度无明显降低,差异无统计学意义。4.qRT-PCR测定RAW264.7细胞NOX1及NOX4的m RNA表达显示,RANKL组比Control组的NOX1及NOX4在3、5、7天时m RNA表达量均明显增高,差异有统计学意义。通过WB检测RANKL组NOX1及NOX4蛋白相对表达量在3、5、7天较Control组均明显增加,差异有统计学意义;RANKL+ICA 10-8M组NOX4的m RNA表达较RANKL组在3、5、7天均有所降低,差异有统计学意义;RANKL+ICA 10-8M组NOX1的m RNA表达较RANKL组在5、7天时有所降低,差异有统计学意义,而第3天的RANKL+ICA10-8M组NOX1的m RNA表达较RANKL组降低,但差异无统计学意义。RANKL+ICA 10-8M组NOX1及NOX4蛋白相对表达较RANKL组在3、5、7天无明显差别,差异无统计学意义。RANKL+ICA 10-6M组的NOX1及NOX4的m RNA及蛋白相对表达量在3、5、7天比RANKL组均有所降低,差异有统计学意义5.测定破骨细胞标志-NFATc1及TRAP的表达显示,RANKL组NFATc1及TRAP的m RNA及蛋白相对表达量在3、5、7天较Control组均明显增高,差异有统计学意义。RANKL+ICA 10-8M组NFATc1的m RNA表达较RANKL组在3、5、7天均降低,差异有统计学意义,RANKL+ICA 10-8M组TRAP的m RNA表达较RANKL组在5、7天均降低,差异有统计学意义;RANKL+ICA 10-8M组TRAP的m RNA表达较RANKL组在第3天有所降低,但差异无统计学意义,RANKL+ICA 10-8M组NFATc1及TRAP蛋白相对表达量在3、5、7天较RANKL组未有明显变化,差异无统计学意义。RANKL+ICA 10-6M组NFATc1及TRAP的m RNA表达较RANKL组在3、5、7天均明显降低,差异有统计学意义;RANKL+ICA 10-6M组的NFATc1及TRAP的蛋白相对表达量较RANKL组也降低,差异有统计学意义。结论:RANKL诱导下RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中细胞内ROS明显升高,说明ROS参与破骨细胞的分化过程。而且测定NOX1及NOX4在破骨细胞分化过程中不同时间点均明显升高,说明在破骨细胞分化过程中ROS主要通过NOX1及NOX4催化生成。ICA可以抑制RANKL诱导下的NOX1及NOX4的表达来抑制ROS生成,从而抑制破骨细胞的分化过程。第二部分探讨淫羊藿苷ICA抑制RANKL诱导RAW264.7细胞破骨分化中与雌激素受体的关系目的:通过ICI 182780来阻断雌激素受体（Estrogen receptor,ER）的激活来探究淫羊藿苷（Icariin,ICA）是否通过与雌激素受体ER结合来发挥其抑制RANKL诱导下RAW264.7向破骨细胞分化的作用。方法:1.RAW264.7细胞分为6组Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-6M组、RANKL+ICI 10-6M组、RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组及RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组。RANKL均为50ng/ml;ICI指ICI 182780浓度为10-6M。2.通过DCFH-DA及DHE两种荧光探针检测Control组、RANKL组、RANKL+ICA10-6M组、RANKL+ICI 10-6M组及RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组细胞内ROS生成。3.应用实时定量PCR法（qRT-PCR）及蛋白印迹法（Western bolt）测定Control组、RANKL组、RANKL+ICI 10-6M组、RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组及RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组在不同时间点NOX1及NOX4的表达。4.应用实时定量PCR法（qRT-PCR）及蛋白印迹法（Western bolt）测定Control组、RANKL组、RANKL+ICI 10-6M组、RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组及RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组在不同时间点破骨细胞特征性标志-NFATc1及TRAP的表达。结果:1.通过DCFH-DA及DHE处理后测定各组ROS含量显示:RANKL+ICI 10-6M组相较RANKL组ROS明显增加,差异有统计学意义。而RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组与RANKL+ICI 10-6M组对比,RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组ROS较RANKL+ICI 10-6M明显降低,差异有统计学意义。2.qRT-PCR及WB测定RAW264.7细胞NOX1及NOX4的m RNA及蛋白相对表达显示,RANKL+ICI 10-6M组相较RANKL组其NOX1及NOX4的m RNA表达量在3、5、7天时均明显增高,差异有统计学意义;通过WB检测NOX1及NOX4蛋白相对表达量在3、5、7天较RANKL组均明显增加,差异有统计学意义。RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组与RANKL+ICI 10-6M组比较发现:RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组NOX1及NOX4的m RNA及蛋白相对表达量在3、5、7天较RANKL+ICI 10-6M组均有所降低,差异有统计学意义。而RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组相比RANKL+ICI 10-6M组中发现,RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组的NOX1及NOX4的m RNA表达量在3、5、7天较RANKL+ICI 10-6M组均有所降低,差异有统计学意义;但RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组NOX1及NOX4蛋白相对表达量在3、5、7天较RANKL+ICI 10-6M组未出现降低,差异无统计学意义。3.qRT-PCR及WB测定破骨细胞标记NFATc1及TRAP的表达显示,RANKL+ICI10-6M组相较RANKL组其NFATc1及TRAP的m RNA及蛋白相对表达量在3、5、7天时均明显增高,差异有统计学意义。RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组相比RANKL+ICI 10-6M组发现,RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组NFATc1及TRAP的m RNA及蛋白相对表达量在3、5、7天较RANKL+ICI 10-6M组均有所降低,差异有统计学意义。而RANKL+ICI10-6M+ICA 10-8M组相比RANKL+ICI 10-6M组中发现,RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组NFATc1及TRAP的m RNA表达量在3、5、7天较RANKL+ICI 10-6M组均有所降低,差异有统计学意义,但RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组的NFATc1及TRAP蛋白相对表达量在3、5、7天较RANKL+ICI 10-6M组未出现降低,差异无统计学意义。结论:ICI 182780无法阻断淫羊藿苷ICA对RANKL诱导下的RAW264.7细胞向破骨分化的抑制作用,说明ICA对破骨细胞分化抑制功能并不是依赖通过与雌激素受体ER结合并激活来发挥的。ICI 182780可以通过增加RANKL诱导下RAW264.7细胞的NOX1及NOX4的表达来促进ROS生成,从而促进向破骨细胞分化。第三部分淫羊藿苷ICA对RAW264.7细胞向破骨分化的Nrf2/KEAP1通路影响目的:探讨淫羊藿苷（Icariin,ICA）对RANKL诱导下RAW264.7细胞向破骨细胞分化的Nrf2/KEAP1通路的影响。方法:1.RAW264.7细胞分为7组Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-8M、RANKL+ICA 10-6M组、RANKL+ICI 10-6M组、RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组和RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组。2.通过蛋白印迹法（Western bolt）测定各组蛋白的相对表达量。7组细胞相同环境下培养3天后,收集细胞并提取各组细胞的胞浆及细胞核的Nrf2蛋白以及胞浆内的KEAP1蛋白。结果:1.Nrf2/KEAP1参与RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分过程。RANKL组的胞浆Nrf2蛋白及核Nrf2蛋白的相对表达量较Control组均有所降低,差异有统计学意义。RANKL组的KEAP1蛋白的相对表达量较Control组明显增加,差异有统计学意义。2.淫羊藿苷ICA可以调节RANKL诱导下RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程的Nrf2及KEAP1的表达。RANKL+ICA 10-6M组与RANKL组相比,RANKL+ICA 10-6M组的核Nrf2蛋白相对表达量均较RANKL组更高,差异有统计学意义。而RANKL+ICA 10-6M组胞浆Nrf2蛋白的相对表达量较RANKL组低,差异有统计学意义。RANKL+ICA10-8M组胞浆Nrf2蛋白及核Nrf2蛋白相对表达量较RANKL组无明显变化,差异无统计学意义。3.ICI 182780可以调节Nrf2/KEAP1的表达。RANKL+ICI 10-6M组胞浆Nrf2蛋白相对表达量比RANKL组更高,差异有统计学意义;RANKL+ICI 10-6M组的核Nrf2蛋白相对表达量较RANKL组更低,差异有统计学意义;RANKL+ICI 10-6M组胞浆KEAP1蛋白相对表达量较RANKL组更高,差异有统计学意义。4.ICI 182780阻断雌激素受体ER后,无法抑制ICA对Nrf2/KEAP1的调节。RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组胞浆Nrf2蛋白的相对表达量比RANKL+ICI 10-6M组明显降低,差异有统计学意义;RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组的核Nrf2蛋白的相对表达量较RANKL+ICI 10-6M组明显升高,差异有统计学意义,RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-6M组胞浆KEAP1蛋白的相对表达量较RANKL+ICI 10-6M组明显降低,差异有统计学意义。RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组胞浆Nrf2蛋白的相对表达量较RANKL+ICI 10-6M组无明显变化,差异无统计学意义;RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组的核Nrf2蛋白的相对表达量较RANKL+ICI 10-6M组明显升高,差异有统计学意义;RANKL+ICI 10-6M+ICA 10-8M组胞浆KEAP1蛋白的相对表达量较RANKL+ICI 10-6M组降低,差异有统计学意义。结论:ICA可以通过Nrf2/KEAP1通路调节发挥抑制RANKL诱导下的RAW264.7向破骨细胞分化的作用。ICI 182780可以影响RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞分化中Nrf2/KEAP1的表达。ICI 182780无法阻断ICA对Nrf2/KEAP1的调控作用。第四部分淫羊藿苷ICA对RAW264.7细胞破骨分化的基因表达模式及功能的影响目的:探讨淫羊藿苷（Icariin,ICA）对RANKL诱导下RAW264.7细胞向破骨细胞分化的基因表达谱的影响。方法:1.RAW264.7细胞分为3组Control组、RANKL组、RANKL+ICA 10-6M组。2.三组细胞相同环境下培养7天后,收集细胞并提取各组总RNA经纯化后构建c DNA文库,送联川生物公司采用illumina NovaseqTM6000平台进行转录组测序,筛选三组之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行功能分析和KEGG pathway分析。结果:1.测序后进行比较得出Control组与RANKL组差异基因有228个,包含56个上调,172个下调;RANKL组与RANKL+ICA 10-6M组相比,差异基因有61个,包括23个上调,38个下调;Control组与RANKL+ICA 10-6M组相比,差异基因有215个,包括61个上调,154个下调。2.RANKL+ICA 10-6M组与RANKL组相比在GO富集分析显示,生物过程的前10条GO注释,GOID以及在该ID上差异表达基因,依据富集得分依次如下:t RNA摆动腺苷到肌苷编辑（t RNA wobble adenosine to inosine editing,GO:0002100,Gm49322）;丙氨酰-t RNA氨基酰化（alanyl-t RNA aminoacylation,GO:0006419,Gm27029）;Th1细胞分化（T-helper 1 cell differentiation,GO:0045063,Hmgb1）;正向调节胞内钙离子浓度（positive regulation of cytosolic calciumion concentration,GO:0007204,Cxcr5,Hmgb1）;树突棘发育的正调控（positive regulation of dendritic spine development,GO:0060999,Adam1a）;JNK级联正调控（positive regulation of JNK cascade,GO:0046330,Hmgb1）;肿瘤坏死因子分泌（tumor necrosis factor secretion,GO:1990774,Hmgb1）;CD4阳性的α-βT细胞分化的负调控（negative regulation of CD4-positive,alphabeta T cell differentiation,GO:0043371,Hmgb1）;天冬氨酸跨膜运输（aspartate transmembrane transport,GO:0015810,Lrrc8d）。分子功能的前10条GO注释,GOID以及在该ID上差异表达基因,依据富集得分依次如下:外脱氧核糖核酸酶III活性（exodeoxyribonuclease III activity,GO:0008853,Trex1）;RNA-DNA杂交核糖核酸酶活性（RNA-DNA hybrid ribonuclease activity,GO:0004523,Fen1）;5’-瓣核酸内切酶活性（5’-flap endonuclease activity,GO:0017108,Fen1）;交叉形成四路连接DNA结合（crossed form fourway junction DNA binding,GO:0000402,Hmgb1）;开放式四向连接DNA结合（open form four-way junction DNA binding,GO:0000401,Hmgb1）;t RNA特异性腺苷-34脱氨酶活性（t RNA-specific adenosine-34 deaminase activity,GO:0052717,Gm49322）;皮瓣核酸内切酶活性（flap endonuclease activity,GO:0048256,Fen1）;3’-5’-脱氧核糖核酸酶活性（3’-5’-exodeoxyribonuclease activity,GO:0008296,Trex1）;钙依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（calcium-dependent protein serine/threonine kinase activity,GO:0009931,Adam1a）;C-X-C趋化因子受体活性（C-X-C chemokine receptor activity,GO:0016494,Cxcr5）。细胞组分的前10条GO注释,GOID以及在该ID上差异表达基因,依据富集得分依次如下:循环内体膜（recycling endosome membrane,GO:0055038,Scamp4）;跨高尔基网络膜（trans-Golgi network membrane,GO:0032588,Scamp4）;胞质微管（cytoplasmic microtubule,GO:0005881,Dynlt1a）;核染色体端粒区（nuclear chromosome,telomeric region,GO:0000784,Fen1）;早期内体（early endosome,GO:0005769,Hmgb1）;核斑点（nuclear speck,GO:0016607,Cbll1）;溶酶体（lysosome,GO:0005764,H2-Ob）;隔膜细胞骨架（septin cytoskeleton,GO:0032156,Adam1a）;分泌囊泡（secretory vesicle,GO:0099503,Dynlt1a）;MHC II类蛋白复合物（MHC class II protein complex,GO:0042613,H2-Ob）。3.利用KEGG数据库,对差异蛋白编码基因进行Pathway分析,前10条KEGG注释及KEGGID:系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,ko05322）;碱基切除修复（Base excision repair,ko03410）;坏死性凋亡（Necroptosis,ko04217）;酗酒（Alcoholism,ko05034）;非同源末端连接修复（Non-homologous end-joining,ko03450）;哮喘（Asthma,ko05310）;DNA复制（DNA replication,ko03030）;用于产生Ig A的肠道免疫网络（Intestinal immune network for Ig A production,ko04672）;同种异体排斥（Allograft rejection,ko05330）;移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease,ko05332）。结论通过对RANKL+ICA 10-6M组与RANKL组通过转录组测序分析发现,差异基因共61个,上调38个,下调23个。经过GO富集分析以后得到一个破骨细胞分化相关基因Hmgb1下调,ICA可能通过调节Hmgb1来抑制破骨细胞分化。WB结果显示ICA可以降低Hmgb1蛋白的相对表达。通过KEGG富集分析以后,Necroptosis通路在RANKL+ICA 10-6 M组下调趋势最高,有明显差异。此外还有Cell adhesion molecules（CAMs）通路及Chemokine signaling pathway通路都与ICA对破骨细胞分化的调控有一定的相关性,值得进一步研究。