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1研究目的本实验采用UAS-Gal4系统对果蝇NAD合成酶CG9940基因进行表达调控,采用果蝇运动装置对果蝇进行耐力运动,通过检测果蝇心脏功能来研究CG9940基因过表达、沉默联合耐力运动干预对果蝇心脏增龄变化的影响,同时检测运动能力和统计生命周期,为NAD合成酶CG9940基因联合耐力运动干预在抗衰老方面的研究提供全面科学的理论依据。2研究方法果蝇基因型:CG9940过表达系(y[1]w[67c23]P{y[+m8]=Mae-UAS.6.11}CG9940[GG01267])、CG9940干扰系(PBac{WH}CG9940f04110)、W1118野生型和arm-Gal4调控系(美国伯明翰研究所提供)。雌性W1118、CG9940过表达系和CG9940沉默系均与雄性调控系arm-Gal4杂交,取F1代,进行分组。野生型F1代分组为:1周对照组(1W-C-W1118/arm-Gal4)、6周对照组组(6W-C-W1118/arm-Gal4)、6周运动组(6W-EW1118/arm-Gal4);过表达系F1代分组为:1周对照组(1W-C-OpCG9940/arm-Gal4)、6周对照组(6W-C-Op-CG9940/arm-Gal4)、6周运动组(6W-E-Op-CG9940/arm-Gal4);沉默系F1代分组为:1周对照组(1W-C-RNAi-CG9940/arm-Gal4)、6周对照组(6W-CRNAi-CG9940/arm-Gal4)和6周运动组(6W-E-RNAi-CG9940/armGal4)。采用第3代果蝇运动装置,运动组均从第8天龄开始运动,运动负荷根据果蝇训练情况进行梯度增减,电机转速从第2周至第6周分别控制为0.18r/s、0.20r/s、0.18r/s、0.16r/s和0.14r/s,每次训练1.5h,连续训练5周,每周休息2天,运动方案结束,24时后取材。指标检测:从三个构建品系中均随机挑选果蝇10只进行RT-PCR检测品系构建,各组随机挑选30只果蝇进行M-mold心脏功能检测,100只果蝇做攀爬能力检测,200只果蝇统计生命周期。3研究结果3.1 RT-PCR检测结果与W1118/arm-Gal4组相比,Op-CG9940/arm-Gal4组表达升高(P<0.01),过表达率为127.27%;RNAi-CG9940/arm-Gal4组表达下降,过表达率为-72.72%。说明F1代果蝇CG9940基因过表达、干扰品系构建成功。3.2心脏功能检测结果与6W-C-W1118/arm-Gal4组相比,6W-C-Op-CG9940/arm-Gal4组心率无明显差异(P=0.87),缩短分数增大(P<0.05),心率不齐指数降低(P<0.05);6W-C-RNAi-CG9940/arm-Gal4与6W-C-W1118/armGal4组相比,心率减慢(P<0.05),缩短分数无明显变化(P=0.43),心律不齐指数无差异(P=0.58)。提示CG9940基因表达上调能增强中老龄果蝇心脏功能,并降低心律失常发生的风险,而CG9940基因表达下调导致中老龄果蝇心率减慢。与6W-C-W1118/arm-Gal4组相比,6W-E-W1118/arm-Gal4组心率减慢(P<0.05),缩短分数增大(P<0.01),心律不齐指数降低(P<0.05)。提示运动训练能改善野生型中老龄果蝇心脏功能,并降低心律不齐发生的风险。与6W-C-Op-CG9940/arm-Gal4组相比,6W-E-Op-CG9940/armGal4组心率减慢(P<0.01),缩短分数增大(P<0.01),心律不齐指数降低(P<0.01)。提示运动训练能改善CG9940基因过表达的中老龄果蝇心脏功能,并降低心律不齐发生的风险。与6W-C-RNAi-CG9940/arm-Gal4组相比,6W-E-RN Ai-CG9940/arm-Gal4组心率无明显变化,缩短无明显变化,心律不齐指数减小(P<0.01)。提示运动训练对CG9940基因过表达下调的中老龄果蝇心脏功能无影响,但能降低心律不齐发生的风险。3.3攀爬能力检测结果与6W-C-W1118/arm-Gal4组相比,6W-C-Op-CG9940/arm-Gal4组攀爬指数增加(P<0.05),6W-C-RNAi-CG9940/arm-Gal4攀爬指数减小(P<0.01),提示CG9940基因表达上调能提高中老龄果蝇运动能力,而该基因下调能导致中老龄果蝇运动能力减弱。与6W-C-W1118/arm-Gal4组相比,6W-E-W1118/arm-Gal4组攀爬指数增加(P<0.05);与6W-C-Op-CG9940/arm-Gal4组相比,6W-E-Op-CG9940/arm-Gal4组攀爬指数增加(P<0.05);与6W-CRNAi-CG9940/arm-Gal4组相比,6W-E-RNAi-CG9940/arm-Gal4组攀爬指数无明显变化。提示运动训练能够增强野生型、CG9940过表达型中老龄果蝇运动能力,对CG9940基因表达下调型中老龄果蝇运动能力无明显影响。3.3生命周期统计结果与C-W1118/arm-Gal4组果蝇生命周期比较,E-W1118/arm-Gal4组寿命延长(P<0.05);与C-Op-CG9940/arm-Gal4组果蝇生命周期比较,E-Op-CG9940/arm-Gal4组寿命延长(P<0.05);C-RNAi-CG99940/arm-Gal4组果蝇生命周期比较,E-RNAi-CG9940/arm-Gal4组生命周期无明显差异(P>0.05)。提示CG9940正常表达和表达上调遗传背景下,运动训练有助于延长果蝇寿命,而CG9940表达下调遗传背景下,运动训练无延寿作用。4结论4.1利用UAS-Gal4系统成功构建CG9940基因表达上调、下调果蝇品系,我们发现上调NAD合成酶基因CG9940表达能提高幼龄果蝇心脏功能和运动能力,延缓中老龄果蝇心脏功能和运动能力的增龄衰退,降低心律异常发生的风险,延长寿命;下调NAD合成酶基因CG9940表达尽管能提高幼龄果蝇运动能力,但对幼龄果蝇心脏射血功能无明显影响,能加快中老龄果蝇心率增龄衰减和运动能力退化,缩短寿命。4.2在不同的遗传背景下,运动对果蝇心脏功能和运动能力增龄变化的影响有差异。对于野生型和CG9940基因表达上调型果蝇,运动延缓中老龄果蝇心脏功能和运动能力增龄衰退,降低心律异常增龄升高发生风险,对寿命延长有积极效应,且CG9940基因表达上调型果蝇的运动效果最好;G9940基因表达下调型果蝇进行运动干预,能减轻中老龄果蝇心律异常增龄升高的发生风险,但不能延缓中老龄心脏功能和运动能力的增龄衰退,不能减轻寿命的缩短。4.3果蝇NAD合成酶基因CG9940是与心脏功能、运动能力和衰老密切相关的基因,上调NAD合成酶基因CG9940并进行运动干预,会使二者对中老龄果蝇有利效应产生叠加,与正常表达和下调表达基因CG9940的运动果蝇相比,表现出最强的心脏功能、运动能力和最长的寿命,体现出良好生活质量。