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目的：当血管内膜受损时，位于血管中膜的血管平滑肌细胞(VSMC)在生长因子和细胞因子的刺激下由收缩表型转化为合成表型，并获得向内膜下迁移、增殖及合成和分泌大量细胞外基质(ECM)的能力。VSMC迁移主要是由ECM蛋白和细胞表面整合素受体(主要是αvβ3)相互作用所介导的。已经证明，在各种ECM蛋白中，骨桥蛋白(OPN)与细胞迁移和黏附的关系最为密切。OPN通过它所含有的RGD序列与整合素αvβ3、αvβ5相互作用，通过SVVYGLR序列与整合素α9β1、α4β1结合。已经证实，含RGD和SVVYGLR序列的短肽能够竞争性的抑制OPN与多种整合素的结合，从而抑制VSMC以及炎性细胞的黏附和迁移。因此，这些小分子肽可作为预防和治疗动脉粥样硬化、PTCA术后再狭窄等血管重塑性疾病的拮抗药物。但是，目前小分子肽主要靠人工化学合成，因价格昂贵而限制了其临床应用。为此，本实验利用基因重组技术，将含有编码RGD序列的cDNA片段与携带GST编码序列的原核表达载体重组，构建RGD多拷贝重组子，将其转化大肠杆菌表达GST-RGD融合蛋白，经分离纯化后获得GST-RGD纯品，为研究RGD多拷贝短肽在防治血管内膜增生中的作用奠定了实验基础。
方法：
1重组表达质粒的构建
将编码RGD13肽的DNA(以下简称RGD)片段克隆入pGEM-T载体，构建pGEM-RGD(1)质粒，经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定后，将从重组质粒中切出的RGD(1)片段与经BamHⅠ/BglⅡ双酶切的pGEM-RGD(1)重组质粒连接构建pGEM-RGD(2)质粒，按上述步骤依次进行切割与重组，分别获得pGEM-RGD(4)、pGEM-RGD(6)、pGEM-RGD(8)、pGEM-RGD(12)、pGEM-RGD(14)质粒。所构建的重组质粒经测序鉴定后，用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切出插入片段，将其亚克隆入pGEX-3X载体构建原核表达质粒pGEX-3X-RGD(4～14)。
2GST-RGD融合蛋白在大肠杆菌中的表达
2.1GST-RGD(6)融合蛋白的诱导表达
将pGEX-3X-RGD(6)转化大肠杆菌后，对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行筛选优化，确定GST-RGD(6)融合蛋白诱导表达的最佳条件。在最佳条件下对pGEX-3X-RGD(6)转化菌进行诱导培养后，将菌体裂解后离心，分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE检查融合蛋白在细胞中的存在形式。
2.2GST-RGD(6)融合蛋白的分离纯化
包涵体经反复洗涤后，用十二烷基肌氨酸钠(SKL)进行变性溶解，变性后的融合蛋白经透析复性后，用GST-Sepharose4B亲和层析进行纯化，以得到GST-RGD(6)融合蛋白。
2.3GST-RGD(6)融合蛋白的factorⅩa酶切取纯化后的GST-RGD(6)融合蛋白与factorⅩa混合，23℃条件下孵育6h。酶切产物经SDS-PAGE观察酶切结果。
3GST-RGD(6)融合蛋白生物学活性检测
3.1黏附抑制实验
传代时，将VSMC分别与0、150、300、450mg/L的GST-RGD(6)预孵育1h，然后将细胞接种到用OPN包被的96孔板中，检测单位时间内黏附至孔板上的细胞数，以此表示细胞黏附活性。以人工合成的OPN13肽和GST蛋白作为平行对照，以确定GST-RGD(6)抑制细胞黏附的特异性。
3.2伤口愈合实验
细胞传代时，将VSMC接种于带有玻片的孔板内，细胞生长至100％汇合后，分别加入0、150、300、450mg/L的GST-RGD(6)预孵育1h，取出玻片，用无菌吸头在玻片上划痕。将玻片放回孔板内，每孔加入20mg/LOPN，继续孵育24h后，于低倍镜下观察细胞伤口愈合程度，以此表示细胞的迁移活性。以人工合成的OPN13肽和GST蛋白作为平行对照，以确定GST-RGD(6)抑制细胞迁移的特异性。
结果：
1重组质粒pGEM-RGD和pGEX-3X-RGD的构建
内切酶图谱和测序结果显示，重组质粒pGEM-RGD和pGEX-3X-RGD中所插入的片段与预期长度一致，核苷酸序列正确无误。
2GST-RGD(6)融合蛋白的诱导表达
转化pGEX-3X-RGD(6)的宿主菌经IPTG诱导后可表达30kD的蛋白质，与GST-RGD(6)融合蛋白分子量相一致，该融合蛋白主要以包涵体形式存在。在培养物(OD600=1.5)按1∶50接种于含0.1mmol/LIPTG的LB培养液中，30℃诱导培养9h的条件下，GST-RGD(6)融合蛋白的表达量在菌体蛋白中所占比例最大，此条件作为GST-RGD(6)融合蛋白诱导表达的最佳条件。
3GST-RGD(6)融合蛋白的纯化
经GST-Sepharose4B亲和层析纯化后，每100ml培养物可得到约5mgGST-RGD(6)融合蛋白，纯度为95％。
4GST-RGD(6)融合蛋白的factorⅩa酶切
纯化后的GST-RGD(6)融合蛋白经factorXa切割后，生成26kDGST和4kDRGD(6)两个肽段。
5GST-RGD(6)融合蛋白对细胞黏附的影响
黏附抑制实验结果显示，在所观察的浓度范围内，GST-RGD(6)融合蛋白能剂量依赖性的抑制VSMC在OPN包被板上的黏附，在融合蛋白为450mg/L时，抑制率达57％。其作用与人工合成的OPN13肽相似。
6GST-RGD(6)融合蛋白对细胞迁移的影响
伤口愈合实验结果表明，GST-RGD(6)能剂量依赖性的抑制VSMC迁移，在融合蛋白为450mg/L时，抑制率达60％。
结论：
1成功构建了含有OPNRGD序列13肽基因不同拷贝的pGEX-3X-RGD原核表达质粒。
2经过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件进行优化，GST-RGD(6)融合蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。
3经过对包涵体进行溶解与复性后，表达产物经GST-Sepharose4B亲和层析得到电泳纯的GST-RGD(6)融合蛋白。
4GST-RGD(6)融合蛋白能够剂量依赖性的抑制VSMC在OPN上的黏附。
的VSMC迁移。