【摘 要】
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目的:从铁皮石斛中提取活性多糖组分,研究铁皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharide,DOP）对人正常口腔黏膜上皮角质形成细胞（Keratinocytes,KCs）增殖、分化的影响,以及对KCs在体外炎症模型中炎性细胞因子（IL-6、IL-8、TNF-α）的表达水平和Pg-LPS/TLR2信号通路活化水平的影响,阐明铁皮石斛多糖对人口腔角质形成细胞增殖、分
【基金项目】
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项目名称:促破骨细胞分化相关基因修饰的骨髓间充质干细胞对磷酸钙骨水泥降解成骨的作用研究,项目合同编号:81560190,项目来源:国家自然科学基金项目,项目起止时间:2016年1月1日-2019年12月31日
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目的:从铁皮石斛中提取活性多糖组分,研究铁皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharide,DOP）对人正常口腔黏膜上皮角质形成细胞（Keratinocytes,KCs）增殖、分化的影响,以及对KCs在体外炎症模型中炎性细胞因子（IL-6、IL-8、TNF-α）的表达水平和Pg-LPS/TLR2信号通路活化水平的影响,阐明铁皮石斛多糖对人口腔角质形成细胞增殖、分化以及抗炎保护作用的效果,为开发铁皮石斛应用于口腔相关疾病提供参考依据。方法:1.从铁皮石斛中提取、分离出含量最多的活性多糖组分并作进一步纯化:粗多糖通过Sevage法脱蛋白后,用DEAE-52纤维素柱层析色谱,利用去离子水、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5M Na Cl溶液进行梯度洗脱进行脱色和初分,依次分出6个多糖,按洗脱出来的顺序编号为DOP-1、DOP-2、DOP-3、DOP-4、DOP-5、DOP-6。其中DOP-1是由去离子水洗脱出来的,为中性多糖;其余的5个是一组0.05～0.5M梯度浓度的Na Cl溶液洗脱出来的,为酸性多糖。采用GFC法进行纯化:将含量最多的DOP-1分多次通过Sephadex-G100凝胶色谱柱进一步纯化得到单一的DOP-1。2.体外培养、传代扩增人正常口腔黏膜上皮角质形成细胞,并及时冻存,使实验用的细胞在第4-6代;3.CCK-8试剂检测6.25-400μg/ml浓度的DOP-1对KCs细胞活力的影响;4.CCK-8试剂检测DOP-1KCs增殖能力的影响;5.以无血清、高Ca2+诱导KCs分化,RT-PCR检测DOP-1对KCs分化标志蛋白:兜甲蛋白LOR、内披蛋白IVL基因表达的影响;6.利用Pg-LPS刺激KCs建立体外炎症模型。RT-PCR检测IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平,ELISA检测培养液上清IL-6、IL-8、TNF-α的水平。Western Blot检测Pg-LPS激活受体TLR2活化水平。结果:1.铁皮石斛多糖的提取率为19.70%,总多糖含量为63.76%。2.DOP-1浓度≥200μg/ml对KCs有显著的抑制细胞活力的影响（P<0.0001）,浓度≤100μg/ml则无抑制细胞活力的影响。DOP-1在12.5～100μg/ml的浓度范围内,促KCs增殖能力与其浓度呈负相关关系。3.高浓度DOP-1（50、100μg/ml）具有明显抑制KCs表达兜甲蛋白的作用（P<0.01）,对内披蛋白的表达无明显影响,说明此浓度的DOP-1对KCs角化有一定抑制作用。4.DOP-1在12.5～100μg/ml的浓度范围内,对Pg-LPS诱导KCs表达、分泌IL-6、IL-8、TNF-α,及对TLR2受体蛋白活化有抑制作用,并与浓度呈正相关关系,说明DOP-1具有抗炎、抗凋亡的作用,并呈浓度依赖性。结论:1.铁皮石斛中最多的活性多糖组分为中性多糖（DOP-1）;2.低浓度的DOP-1（≤100μg/ml）促进KCs增殖,较高浓度的DOP-1会延缓KCs分化,高浓度（≥200μg/ml）则明显抑制KCs的细胞活性;3.DOP-1可提高角质形成细胞的抗炎能力并与其药物浓度呈一定正相关性。
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