电化学发光（ECL）兼具了电化学分析的可控性和发光分析技术的灵敏性,具有灵敏度高、操作简单、可控性强、分析快速等优点。ECL生物传感器是通过生物敏感界面将生物识别信息转化成ECL信号,将ECL技术的高灵敏度与生物识别的高特异性相结合,在生物活性小分子、蛋白酶、肿瘤标志物以及细胞等多种类型的靶标检测中发挥着越来越重要的作用。蛋白酶含量与生物活性的异常会反映于病理过程,在肿瘤的发现、诊疗与预后判断等方面起到关键作用,故对酶的灵敏检测有利于临床疾病诊断与药物评估。构建对血液、细胞中酶活性高效、灵敏检测的ECL酶生物传感器主要考虑到两个方面:（1）选择生物相容性好、ECL性能好的新型ECL纳米材料,以增加传感器的生物应用范围与响应灵敏度;（2）将高效的酶催化反应与核酸扩增技术结合,通过信号开关设计,以降低传感器的背景信号与检测限。鉴于此,本论文一方面从ECL反应界面微环境的设计入手,利用多孔材料提供的微纳空间,制备生物相容性好、ECL性能好的纳米型电化学发光体。另一方面发展酶催化反应激活的高效DNA步行器（walker）信号扩增策略,构建高性能ECL生物传感平台来实现对酶活性的灵敏检测。本论文的具体研究工作主要分为以下几部分:1.聚半胱氨酸多孔膜内原位生成铜纳米簇结合DNA walker构建ECL生物传感器用于碱性磷酸酯酶活性检测金簇、银簇等贵金属纳米簇作为新型的纳米型ECL发光体,凭借其化学稳定性好、量子产率高、生物相容性好等优点,在构建传感器的研究中取得了突出的进展。与金簇、银簇相比,铜簇（Cu NCs）更具有高丰度,低成本的优势、因而更具有商业应用潜力。然而,铜簇表面的铜原子化学活性强,易于被氧化或自发聚集,导致其明显的非辐射驰豫,故其ECL的强度和稳定性难以达到生物分析的要求。本工作以聚L-半胱氨酸（poly-L-Cys）膜为模板,通过原位电化学还原Cu2+,在poly-L-Cys多孔膜内原位生成Cu NCs,显著提升其电化学发光效率和稳定性。poly-L-Cys多孔结构调节Cu NCs在其微纳孔洞中生成,这不仅有效地限制配体的分子内振动和旋转,基于孔道限域效应也加快电极表面附近的电子转移,同时poly-L-Cys还作为共反应促进剂,加速共反应剂S2O82-的还原,大大提高Cu NCs的ECL效率。另一方面,设计由目标物碱性磷酸酯酶（ALP）触发的点击化学,以激活DNA walker扩增策略构建信号开关,开发了ALP生物传感器,其线性范围为10-8 U·L-1～10-2 U·L-1,检测限低至9.5×10-7 U·L-1。该生物传感器结合高特异性的酶催化反应和DNA walker扩增策略具有显著提高的灵敏度和识别效率,在非核酸靶点检测和疾病诊断方面具有广阔的前景。2.中空二氧化钛-红荧烯复合纳米发光体结合双足DNA walker构建ECL传感器用于甲基化转移酶活性的检测具有大π共轭芳香族结构的多环芳烃（PAHs）,如红荧烯（Rub）等,凭借易于合成、结构可控、物理化学稳定性好等优点,作为ECL材料获得研究者们的关注。尽管,利用再沉淀法合成的Rub纳米晶,显著改善了其水溶性差、自由基离子稳定性弱等缺点,然而由于纳米晶呈现紧密堆积状态,存在明显的内滤效应,导致ECL效率受限。中空二氧化钛（Ti O2）具有优异的光电特性和与Rub的有效结合能力,而且其中空结构能够为Rub提供一个限域的微环境,提高Rub的表面电荷,以增强其ECL性能,为Rub作为ECL发光体的广泛应用提供了可能。因此,本工作以外层包裹红荧烯的中空Ti O2复合物为纳米型电化学发光体,内源性溶解氧为共反应剂,钯纳米颗粒为共反应促进剂,构建三元ECL体系。基于此,设计由目标物Dam甲基转移酶（Dam MTase）转化而成的双足DNA walker,在顶部修饰有猝灭探针的DNA线框轨道上自主、定向地高效行走,实现对Dam MTase的灵敏检测。本工作设计的由DNA立方体连接形成的线框轨道,可以优化步行链与轨道的接触区域,加强步行链和指定轨道之间的动态相互作用,以减少步行链脱轨的可能性,提高行走的效率。该传感器对Dam MTase的检测具有较低的检测限(2.30×10-8 U·m L-1)和较宽的线性范围(10-7～10-1 U·m L-1),为灵敏、无创的药物疗效评价提供了一个新的范例。