杨树是重要的经济、生态树种,也是我国防护林的主要栽培树种。在育种工作中发现,多个天然加倍的三倍体杨树,其性状优良,生长速率、抗性和材质等指标都超越二倍体,但由于林木的遗传背景复杂,目前对三倍体速生性状形成的分子机理研究较少。本研究以黑杨二倍体和三倍体为材料,利用MSAP技术、基因芯片、小RNA测序等手段,从基因表达水平、DNA甲基化水平和miRNA表达水平综合分析黑杨三倍体速生性状形成的相关分子机理。主要结果如下：1.MSAP分析,发现黑杨三倍体不同发育时期(顶芽,幼叶及成熟叶片)的甲基化动态变化与二倍体显著不同,三倍体CHG甲基化从3.23%升高到5.83%,CG甲基化从21.31%降到14.41%,后升高到19.28%。其中CHG甲基化三倍体显著高于二倍体。分别参与CG甲基化的MET1和CHG甲基化的CMT,及建立甲基化的DRM在二倍体和三倍体间表达量差异显著,并且在三倍体叶片发育不同时期,MTase的表达量变化与其相应控制DNA甲基化模式变化基本吻合。21条甲基化差异片段测序发现18条甲基化差异片段位于基因编码区。而且顶芽,幼叶的DNA甲基化水平与表达下调基因数间存在显著相关性,这说明DNA甲基化参与了黑杨三倍体化后的基因表达调控,CG和CHG甲基化可能参与不同的调控机制,CG甲基化参与维持基因组的稳定,CHG甲基化参与特定基因的表达调控。2.利用杨树基因芯片分析黑杨三倍体和二倍体的叶片基因表达差异,共分析到表现上调的转录本1564个,表现下调的转录本2015个,GO分类分析发现151个上调基因分类,94个下调基因分类。上调基因主要参与生长素、油菜素内酯合成代谢,碳氮循环代谢和细胞壁合成代谢。下调基因主要与核酸代谢有关。初步表明黑杨三倍体基因表达受倍性变化的影响,其速生性状形成与基因表达变化有关。3.利用NimbleGene杨树12×135K基因表达谱芯片,首次全面分析黑杨三倍体、二倍体的顶端分生组织,幼叶,木质茎和木质根的基因表达变化,48276个基因中共检测到约2.1万个基因成表达状态,各组织表达基因数接近,但发现部分基因的空间表达位置发生变化。在各组织中检测到数量不等的差异表达基因,茎中差异基因最多,上调基因2307个,下调基因2155个,并且其中特异性在茎中升高和降低的基因为1125个和768个。4.芯片结果GO分类分析显示,黑杨三倍体顶芽中生长发育相关基因表达上调,生长素、细胞壁合成旺盛；幼叶生长素动态平衡、细胞壁合成基因表达同样旺盛；茎中富集了大量生物量调控基因,细胞壁各组分合成、修饰、加厚、沉积等相关过程的基因也表达上调；根中发现根发育相关基因表达上调。组织间差异表达基因分析发现,顶芽、幼叶生长素相关基因表达活跃,顶芽、幼叶、茎中细胞壁合成相关代谢活跃,叶片、茎、根中PCD过程和防御反应基因活跃。这些分析显示了黑杨三倍体速生优势形成的基因表达基础,尤其是茎中大规模的转录调控因子相关基因的表达变化可能与茎的快速生长有关。5.黑杨三倍体茎中检测到促进茎伸长的,BRs信号通路转录因子BES1表达量升高,及其相关信号通路上游受体和相关激酶表达上调,表明黑杨三倍体茎快速发育主要与BRs信号通路的激活有关,同时黑杨多个组织发育的PCD过程也与BRs有关,因此,推测黑杨三倍体各组织的基因表达变化主要与生长素和BRs信号通路的激活有关。6.利用Solexa测序技术,首次分析了黑杨三倍体和二倍体的小RNA的特征,发现小RNA、已知植物miRNA前体聚类结果和杨树已知miRNA前体结果,黑杨三倍体均显著多于二倍体,其中参与甲基化指导的24nt的sRNA丰度最高。与已知miRbase比对,黑杨中共发现773条miRNA与已知miRNA前体有聚类结果。表明,黑杨三倍体受基因组变化的影响产生了大量的sRNA,其中包括siRNA和miRNA,siRNA的大量激活可能与黑杨三倍体的DNA甲基化水平的变化有关,而miRNA的表达量变化则参与基因的表达调控。7.分析了29个杨树已知miRNA,在黑杨二倍体和三倍体的叶片和茎发育的5个时期的表达量变化,发现三倍体叶片发育前期大部分1niRNA的表达量低于同期二倍体,而后期表达量升高；茎中几乎所有miRNA在各个发育时期表达量均高于同期二倍体,这可能是黑杨茎中大规模转录因子表达变化的促发因素。在黑杨三倍体和二倍体中预测了8个新miRNA,通过前体克隆表达分析等手段最终确定4个黑杨新miRNA,预测了miRNA的靶基因,首次在杨树中发现pec-miR3x-2的靶基因为控制sRNA合成的RNA聚合酶Ⅳ的亚基,其表达量的变化与miRNA成反比。分析表明,miRNA确实在黑杨三倍体的发育中呈现不同于二倍体的变化规律,推测这些miRNA的差异表达直接影响了生长素和BRs等相关信号通路基因的表达。8.在黑杨叶片的芯片分析中分离克隆了7个高表达基因和调控相关基因,构建了pRI101-PtSIP3, pRI101-PtISPS, pRI101-PtAIMl, pBI121-PtGDSL, pBI121-PtClpCl, pRI101-Pt674共6个表达载体,除Pt674未获得转基因拟南芥,其余5个杨树基因均转入拟南芥,目前为止,Ptsip3的转基因拟南芥中观察到显著表型变化,过表达Ptsip3在拟南芥中抑制胚和果英发育、促进根的快速生长。推测该基因在黑杨三倍体中的表达升高,可能会参与黑杨三倍体的营养生长期的调控并促进根的发育。结合前期对黑杨二倍体和三倍体的基因组结构、DNA甲基化分析,不同组织的基因表达分析、sRNA测序和miRNA表达分析的结果,认为黑杨三倍体基因组结构没有发生大规模的改变,而黑杨速生性状形成的直接原因是生长素、BRs相关信号通路在三倍体中被激活,而这种激活效应可能源于sRNA的大量表达,其中siRNA大量参与指导DNA甲基化,miRNA的表达变化调控生长发育相关激素基因的表达。黑杨三倍体速生性状的形成与基因组融合和基因组加倍引起的sRNA的激活有关。