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异种器官移植面临的免疫学障碍表现为超急性排斥(HAR)，急性血管排斥反应(AVR)，细胞介导的排斥反应和慢性排斥反应。由于猪血管内皮细胞上的α-Gal表达是天然抗体的靶位点，是引起HAR的重大障碍，α-Gal是通过α-1，3-半乳糖基转移酶(α-1，3-GT)来合成的。人白细胞抗原HLA-G属于非经典的MHCI类抗原，可与NK细胞或细胞毒T细胞(CTL)表面的杀伤细胞抑制性受体(KIR)结合，继而启动细胞内抑制性信号传递通路，抑制NK细胞和CTL的细胞毒效应。为了克服这两个障碍，本研究构建出敲除α-1，3-GT并敲入HLA-G1基因的基因打靶载体并获得敲除α-1，3-GT并敲入HLA-G1基因的体细胞。为今后克隆出表达HLA-G1且不表达α-1，3GT基因的基因修饰猪的研究提供必要的积累，为可以真正用于临床的异种器官以及为其他转基因动物研究打下坚实的基础。 本实验室已克隆到猪α-1，3-半乳糖基转移酶基因(α-1，3-GT)。其中pMD-3arm载体上有4.5kb的片段，该片段包括了大部分第8内含子和一部分第9外显子。本实验中利用PCR的方法，从猪的基因组中获得约1.9kb的猪α-1，3-GT的第9外显子序列的扩增产物，将片段克隆于pGEM-Teasy载体。将4.5kb和1.9kb片段分别作为打靶载体的5’和3’同源臂，以neo为正选择标记基因，以GFP为负筛选标记基因，构建敲除猪α-1，3-半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HLA-G1基因的打靶载体p ZJ，打靶载体全长约15.5kb。 从妊娠38日孕猪体内采集到3个猪胎儿，分离出猪胎儿成纤维细胞，经体外传代培养建立细胞系，其中一个长势良好。用Sry-PCR法和染色体核型分析法鉴定细胞系的性别， 采用优化的脂质体转染法将pZJ转染猪胎儿成纤维细胞，经7天G418(600μg／ml)药物筛选，共获得30个neo阳性细胞克隆，其中12个为非绿色细胞克隆，仅有7个可以扩大培养。对其进行PCR检测，其中3个非荧光阳性单克隆细胞为定点整合阳性。 以同样的脂质体转染条件将pZJ转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418(600μg／ml)药物筛选，扩大培养后有7个生长繁殖状况良好。对其进行PCR检测，其中2个均为定点整合阳性。 本课题的完成将为下一步在细胞水平的研究及制备基因修饰体细胞克隆猪、牛工作提供必要的积累。