研究背景与目的食管癌是发展中国家最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国作为食管癌发病率和死亡率最高的国家之一,人们的生命安全和生活质量因此而受到严重威胁。探索食管癌的发生和发展机理,寻找灵敏度和特异度均较高的食管癌早期诊断标志物,对于食管癌高危人群筛检以及降低其发病率和死亡率具有重大意义。本研究在miRNA微阵列芯片结合生物信息学分析的基础上,通过扩大人群样本量,利用实时荧光定量PCR技术验证并建立了食管癌患者与健康人群的血浆miRNA差异表达谱,结合食管癌细胞外泌体miRNA高通量测序分析,从差异表达的血浆miRNA表达谱中选取miR-21-5p和miR-93-5p进行后续的功能研究,探索食管癌细胞外泌体来源的miR-21-5p和miR-93-5p在食管癌微环境中,对食管癌细胞自身、血管内皮细胞及肿瘤相关巨噬细胞的生物学作用,通过识别各自调控的靶基因及下游相关信号通路,初步探讨外泌体穿梭miR-21-5p和miR-93-5p在食管癌微环境中的作用机制,并评价两者对于食管癌的诊断价值,为阐明食管癌的发展机理、发现早期诊断标志物提供研究线索。研究方法1.利用差速结合超速离心法分离食管癌细胞EC9706培养上清来源的沉淀物后,采用透射电镜观察和Western blot蛋白定性相结合的方法鉴定此沉淀物。提取沉淀物总RNA,应用新一代Solexa高通量测序构建EC9706细胞及此沉淀物的小RNA文库,主要包括小RNA分离、连接酶加接头、RT-PCR、PCR产物割胶回收和纯化几个步骤,通过进一步的生物信息学分析比较EC9706细胞及其沉淀物中成熟miRNAs和未知miRNAs的表达丰度,识别成熟miRNAs的异构体,并采用实时荧光定量RT-PCR验证表达水平较高的5个miRNAs在EC9706细胞及其分泌沉淀物中的表达水平。2.招募87例经病理或内镜诊断明确且未接受放化疗的原发性食管癌患者及87例条件匹配的健康对照者,采用回顾性问卷询问的形式收集患者和对照者的人口学指标及环境因素暴露情况。送检3对食管癌患者和配对对照者的血浆,应用miRNA表达谱芯片筛选差异表达的miRNAs,结合Solexa高通量测序结果,采用实时荧光定量RT-PCR法验证差异表达的miRNAs在扩大人群样本中的表达水平。利用靶基因预测软件(DIANA、TargetMiner、miRTarBase、RNA22)预测候选 miRNAs(miR-21-5p 和 miR-93-5p)的靶基因,Gene Ontology和KEGG数据库分别对预测靶基因进行功能富集和Pathway注释。条件logistic回归分析差异表达的血浆miR-21-5p和miR-93-5p与食管癌发病风险之间的关系,ROC曲线下面积预测两者对食管癌的诊断价值,并分析它们与环境危险因素之间的交互作用。3.构建体外细胞共培养模型,将Cy3标记的miR-21-5p和miR-93-5pmimics转染的EC9706细胞作为供体细胞,观察Cy3-miR-21-5p和Cy3-miR-93-5p在供体EC9706细胞与受体EC9706细胞之间的传递,采用实时荧光定量RT-PCR法检测外泌体穿梭miR-21-5p和miR-93-5p的传递效率。在此基础上分别采用EdU染色法、Annexin V-FITC&PI双染法、Transwell穿膜法及流式细胞术检测受体EC9706细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力及周期分布。实时荧光定量RT-PCR法和Western blot分别检测在mRNA和蛋白水平上,外泌体穿梭miR-21-5p对其靶基因PDCD4、外泌体穿梭miR-93-5p对其靶基因PTEN的调控作用,构建野生型和突变型的靶基因3’UTR载体,采用双荧光素酶报告基因实验验证在EC9706细胞中miR-21-5p和miR-93-5p与各自靶基因的调控关系。进一步检测了外泌体穿梭miR-21-5p所调控PDCD4下游通路中肿瘤迁移和侵袭相关基因MMP2、MMP9的表达水平,以及外泌体穿梭miR-93-5p对受体EC9706细胞中周期相关基因p21、Cyclin D1的表达调控。4.观察并检测Cy3-miR-21-5p通过体外细胞共培养模型在供体细胞EC9706和受体细胞HUVEC之间的传递及其效率,分别采用EdU染色法、Tianswell穿膜法、体外血管形成实验检测受体细胞HUVEC的增殖、迁移及新生血管形成能力。实时荧光定量RT-PCR法和Western blot检测外泌体穿梭miR-21-5p对靶基因PTEN mRNA和蛋白水平的调控,双荧光素酶报告基因实验验证miR-21-5p是否能与PTEN 3’UTR结合。Western blot检测受体细胞HUVEC 中 PTEN 下游 PI3K/Akt/eNOS/NO 通路中 p-Akt(Ser473)、p-eNOS(Ser1177)及增殖相关蛋白p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)的表达水平,《一氧化氮(NO)测试盒》检测受体细胞HUVEC培养上清中NO含量,荧光定量RT-PCR法检测迁移相关基因MMP2、MMP9的mRNA水平。5.采用佛波酯、人重组白细胞介素4对人急性单核白血病细胞THP-1进行序贯作用处理,以诱导肿瘤相关巨噬细胞TAM的生成。分别将miR-21-5p和miR-93-5p mimics转染的EC9706作为供体细胞,经诱导成功的TAM作为受体细胞,在体外细胞共培养模型下,实时荧光定量RT-PCR法检测外泌体穿梭miR-21-5p和miR-93-5p对受体细胞TAM中自噬相关基因ATG5、ATG12、BECN1、SQSTMA、LC3A和LC3BmRNA表达的影响,用以间接反映受体细胞TAM的自噬水平变化。主要研究成果1.人食管癌细胞EC9706与其分泌外泌体中miRNAs的鉴别与筛选1.1 EC9706细胞来源外泌体的分离与鉴定通过采用差速结合超速离心的方法,从食管癌细胞EC9706培养上清中分离出白色沉淀物,透射电镜下观察白色沉淀物是具有双层膜结构的微囊泡,呈圆形或椭圆形,囊泡直径约30～60nm,符合外泌体的形态学特征;Western blot检测发现白色沉淀物具有外泌体膜蛋白之一 CD63的表达,因此确认此沉淀物为外泌体。1.2 EC9706细胞与其分泌外泌体的miRNA表达谱EC9706细胞及其所分泌外泌体经总RNA提取、质量控制、小RNA测序后各获得15-32nt的特异序列1919950和1226905条,高质量的干净序列的长度分布统计显示绝大多数小RNA位于19～24nt,符合miRNA的序列特征。将细胞和外泌体中miRNA与miRBase18.0数据库中已公布的人类miRNA进行比对,结果发现细胞中有342个已知成熟miRNAs的表达,其中48个在外泌体中也同时表达;另外,两者中共同表达的新miRNA有12个,有20个新miRNAs只在外泌体中特异性表达。MiRNA表达谱分析结果显示,已知的成熟miRNA在外泌体中表达丰度均低于细胞,在所识别的细胞及其分泌外泌体中共同表达的新miRNA中,有8个在外泌体中的表达丰度高于细胞。接着,我们选取了细胞及其分泌外泌体中表达水平均较高的miR-21、let-7a、Iet-7f、miR-26a和miR-27b重新进行了实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示5个miRNAs在EC9706细胞及其分泌外泌体中的表达水平趋势一致,与测序结果基本相符。2.人血浆候选食管癌特异miRNAs的筛选2.1食管癌患者与健康对照人群血浆miRNAs差异表达分析利用Aligent miRNA芯片从3例食管癌患者和3例健康对照者的血浆中筛选出了 20个差异表达的miRNAs,其中15个在食管癌患者血浆中上调,5个下调。与食管癌细胞EC9706及其分泌外泌体中表达丰度均较高的miRNAs相比对,我们选择miR-21-5p、miR-19b-3p、miR-25-3p、miR-93-5p,let-7i-5p进行扩大样本量验证,最后选择表达差异具有统计学意义的miR-21-5p和miR-93-5p作为进一步的研究对象。取四个靶基因预测软件的交集,分别识别了与miR-21-5p、miR-93-5p的候选靶基因相关的GO分析72个和165个,KEGG Pathway注释结果显示miR-21-5p和miR-93-5p调控的靶基因均显著地参与了与癌症发生相关的多条信号通路,如 mTOR、FoxO、PI3K-Akt、TGF-beta 通路等。2.2 人血浆候选食管癌特异miRNAs与食管癌发病风险的研究通过条件logistic回归分析发现食管癌患者血浆miR-21-5p和miR-93-5p的表达上调均可增加食管癌的发病风险,是食管癌发生的危险因素,两者对于食管癌诊断的AUC分别为0.598和0.575,两者联合应用诊断的AUC为0.619。本研究收集的人群流行病学资料分析结果显示,吸烟、饮酒和消化道疾病史的分布在食管癌患者和健康人群之间有统计学差异,提示这三个因素与食管癌的发生具有相关性。MiR-21-5p和miR-93-5p的表达水平与环境暴露、生活习惯之间的交互作用分析结果显示,miR-21-5p的异常表达与吸烟具有显著交互作用,而miR-93-5p的异常表达与职业、饮酒和饮茶有交互作用。3.外泌体穿梭miRNAs对食管癌细胞生物学行为的影响及其机制研究3.1 miR-21-5p和miR-93-5p通过外泌体传递对受体细胞EC9706生物学行为的影响将Cy3-miR-21-5p和miR-93-5p mimics转染的供体EC9706细胞与受体EC9706细胞共培养24h后,镜下观察显示大多数受体EC9706细胞中均可见红色荧光,miR-21-5p和miR-93-5p mimics转染组受体EC9706细胞中miR-21-5p、miR-93-5p的表达水平分别为阴性对照组的2.75和1.44倍,说明miRNAs通过外泌体传递进入了受体EC9706细胞,可进行后续的细胞生物学功能实验。细胞凋亡结果显示,miR-21-5pmimics转染组受体EC9706细胞的早期凋亡率1(%)明显低于阴性对照(miR-NC)组(4.03±0.59vs.5.67±0.71,P<0.05),而miR-93-5p对其凋亡无影响;细胞增殖结果显示,miR-21-5p和miR-93-5p mimics转染组受体EC9706细胞的增殖率分别为(33.02±1.97)%和(36.95±5.58)%,较miR-NC组(30.60±3.91)%明显升高(P<0.05);细胞周期结果显示,miR-93-5p mimics转染组受体EC9706细胞较miR-NC组各时期细胞所占比例虽无显著差异,但有G1/S期阻滞的趋势,miR-21-5p对其周期分布无影响;迁移能力检测结果显示,miR-21-5p mimics转染组受体EC9706 细胞的穿膜细胞数明显多于 miR-NC 组(90.90±7.11 vs.83.40±7.81,P<0.05),而miR-93-5p对迁移无影响;侵袭能力检测结果显示,miR-21-5p mimics转染组受体EC9706细胞的 OD570显著高于 miR-NC 组(0.093±0.006 vs.0.084±0.005,P<0.05),而 miR-93-5p 对侵袭无影响。3.2外泌体穿梭miR-21-5p对受体细胞EC9706生物学行为影响的机制研究利用生物信息学预测方法取四个靶基因预测软件的交集,共筛选出了 55个miR-21-5p的候选靶基因,结合现有的文献报道,挑选与肿瘤细胞凋亡、增殖、迁移、侵袭功能均相关PDCC4作为研究对象。实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测结果显示,miR-21-5p过表达的供体EC9706细胞与受体EC9706细胞共培养24h后,外泌体穿梭miR-21-5p在转录后水平抑制了受体EC9706细胞中PDCD4的蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-21-5p能够与PDCD4 3’UTR区的"AUAAGCU"序列相结合。进一步检测了 PDCD4下游的肿瘤迁移和侵袭基因MMP2、MMP9在受体EC9706细胞中的表达,结果显示MMP2和MMP9的mRNA、蛋白表达水平均显著提高。3.3外泌体穿梭miR-93-5p对受体细胞EC9706生物学行为影响的机制研究选择DIANA、TaigetMiner、miRTarBase、RNA22四个靶基因预测软件均可预测到的PTEN作为miR-93-5p的候选靶基因,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测结果显示,外泌体穿梭miR-93-5p显著抑制了受体EC9706细胞中PTEN的蛋白翻译过程,双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-93-5p与野生型PTEN 3’UTR载体共转染组的荧光素酶活性低于其他各组,PTEN下游周期相关基因P21和CyclinD1的蛋白水平均显著降低。加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后,外泌体穿梭miR-93-5p的促受体EC9706细胞增殖能力明显减弱,G1/S期阻滞趋势亦有所减弱,p21和CyclinD1的蛋白表达分别恢复了 26.71%和10.33%。4.外泌体穿梭miR-21-5p对食管癌细胞生物学行为的影响及其机制研究4.1 miR-21-5p通过外泌体传递对受体细胞HUVEC血管形成的影响将Cy3-miR-21-5p mimics转染的供体EC9706细胞与受体细胞HUVEC共培养24h后,镜下观察显示大多数HUVEC细胞中均可见红色荧光,miR-21-5p mimics转染组HUVEC细胞中miR-21-5p的表达水平为miR-NC组的1.23倍,提示miR-21-5p可通过外泌体传递进入受体细胞HUVEC。细胞增殖结果显示,miR-21-5pmimics转染组的受体细胞HUVEC的增殖率(%)显著高于miR-NC组(61.01±11.88vs.51.60±10.70,P<0.05);迁移能力检测结果显示,miR-21-5p mimics转染组受体细胞HUVEC的穿膜细胞数明显多于miR-NC组(122.10±16.13vs.79.70±7.75,P<0.05);新生血管形成实验结果显示,miR-21-5p组受体细胞HUVEC的血管总长度、血管成环数、血管分支点数目分别是miR-NC组的1.12、1.17、1.17 倍。4.2外泌体穿梭miR-21-5p对受体细胞HUVEC血管形成影响的机制研究结合已有的文献报道,选择四个靶基因预测软件均可预测到且与肿瘤血管形成密切相关的PTEN作为候选靶基因,双荧光素酶报告基因实验显示在HUVEC细胞中miR-21-5p能与野生型PTEN3’UTR区结合,将miR-21-5p过表达的EC9706与HUVEC共培养后,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测结果显示外泌体穿梭miR-21-5p可在转录后水平抑制PTEN的蛋白表达,受体细胞HUVEC中PTEN下游的p-Akt(Ser473)表达增加了 14.18%、p-eNOS(Ser1177)表达降低了 42.13%,HUVEC上清中NO含量无明显改变。加入LY294002后,p-Akt(Ser473)和p-eNOS(Ser1177)的表达水平均有所恢复,而加入eNOS抑制剂L-NAME后,p-Akt(Ser473)并未变化,但p-eNOS(Ser1177)表达水平恢复了 28.08%,同时发现NO下游增殖相关蛋白p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)表达降低并受LY294002和L-NAME的影响,迁移相关基因MMP9的mRNA水平有降低的趋势。5.外泌体穿梭miRNAs对肿瘤相关巨噬细胞自噬调控的初步探索镜下观察显示THP-1细胞经PMA作用48h后由"葡萄串"样成团悬浮生长变为贴壁生长,继续经人重组IL-4序贯作用48h后,细胞形态呈现不规则形,部分伸出伪足,细胞间连接形成,符合TAM的形态学特征。将miR-21-5p和miR-93-5p mimics转染的EC9706细胞与诱导成功的TAM体外共培养,实时荧光定量RT-PCR检测发现miR-21-5p mimics转染组受体细胞TAM中ATG12和BECN1 mRNA表达水平分别是miR-NC组的126、1.63倍,miR-93-5p组受体细胞TAM中BECN1 mRNA表达水平是miR-NC的1.34倍,而其余自噬相关基因(ATG5、SQSTM1、LC3A和LC3B)的mRNA表达水平无组间统计学差异。初步研究结论1.本研究利用差速结合超速离心法成功从食管癌细胞EC9706培养上清中分离出了外泌体,采用Solexa高通量测序技术分别从EC9706细胞及其分泌外泌体中识别出342、48个已知人类miRNAs,已知成熟miRNAs在细胞中的表达水平均高于外泌体,另外在EC9706细胞及其分泌外泌体中还分别发现了 64、32个新miRNAs,在两者共同表达的12个新miRNAs中,8个在外泌体中表达上调,4个表达下调。2.采用微阵列miRNA芯片技术在食管癌患者和健康对照者血浆中共识别了 20个差异表达的miRNAs,经扩大人群样本量的实时荧光定量RT-PCR验证发现miR-21-5p和miR-93-5p在食管癌患者血浆中高表达,两者的表达上调均可增加食管癌的发病风险,且对食管癌具有一定的诊断价值,具有成为食管癌早期诊断标志物的潜力,但由于灵敏度和特异度并不高,尚需扩大样本量以进行更深入的分析。3.在食管癌微环境中,供体食管癌细胞EC9706来源的外泌体穿梭miR-21-5p可能通过自分泌的方式与其靶基因PDCD4共同参与调控影响受体EC9706细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭过程;而供体细胞EC9706来源的外泌体穿梭miR-93-5p则可能通过PTEN/PI3K/Akt信号途径参与调控受体EC9706细胞的周期分布和增殖能力。4.供体细胞EC9706来源的外泌体穿梭miR-21-5p可能通过旁分泌的方式激活PTEN/Akt/eNOS/NO信号通路从而参与调控受体细胞HUVEC的增殖、迁移以及新生血管形成过程,并影响下游增殖和迁移相关基因的表达。5.供体细胞EC9706来源的外泌体穿梭miR-21-5p和miR-93-5p可能通过影响自噬相关基因(ATG12和BECN1)的表达而调节TAM的自噬水平,外泌体穿梭miR-21-5p和miR-93-5p在食管癌微环境中的生物功能学及其机制研究,丰富了细胞间信息交流的途径,增加了细胞间通讯的复杂性,是对传统细胞间通讯方式的补充。