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目的:角膜缘微环境细胞(limbal niche cells,LNCs)在角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem/progenitor cells,LESCs)的调控中发挥重要作用。本研究旨在探索Notch信号通路在LNCs对LESCs的调控中所起的作用。方法:分别使用中性蛋白酶Ⅱ和胶原酶A消化大鼠角膜缘组织。将胶原酶A消化的单个细胞种植于包被Matrigel上,通过连续传代获得纯化的大鼠LNCs。在改良的胚胎干细胞培养基(modified embryonic stem cell medium,MESCM)中,将中性蛋白酶Ⅱ消化的单个细胞种植于3D Matrigel并以MESCM进行培养,部分细胞与LNCs混合后在相同条件下共同培养。针对部分培养进行Notch信号通路的抑制实验(使用DAPT或Notchl-siRNA)或激活实验(使用Jaggedl),并使用RT-PCR、免疫染色和免疫印迹法对LESCs进行检测。结果:中性蛋白酶Ⅱ分离的角膜缘细胞片由PCK+角膜缘上皮细胞(limbal epithelium cells,LECs)构成,胶原酶A分离的角膜缘细胞簇不仅含有PCK+ LECs,还含有部分Vim+角膜缘基质细胞。将角膜缘基质细胞连续传代至P3即获得纯化的LNCs,表达Oct4、Rexl、Sox2、Nanog、SSEA4、N-cadherin 和 CD34 等干细胞标志物。在 3D Mattrigel上,单独培养的LECs(LECs组)分散生长,单独培养的LNCs相互聚集呈星芒状生长,将LECs与LNCs以4:1比例混合(LECs+LNCs组)后,二者相互结合呈cluster样生长,与LNCs结合的LECs均表达p63α。LNCs不仅与p63α+ LESCs相互结合,还阻止了LESCs的分化。Notch信号通路的受体(Notchl)和配体(Deltal和Jagged1)在大鼠角膜和角巩缘均以未激活的形式表达。经过体外培养后,Notch信号在LECs中被激活,且LNCs的参与显著抑制了 Notch信号在LECs中的表达。针对LECs进行Notch信号通路的抑制和激活实验,发现DAPT和Notch1-siRNA均可显著下调LECs中的Notch信号表达,而Jagged1可显著上调LECs中的Notch信号表达。LECs的Notch信号被DAPT或Notch1-siRNA抑制后,p63α表达显著增加,CK12表达显著下降;LECs的Notch信号被Jagged1激活后,p63α表达显著下降,CK12表达显著增加;p63α和CK12在DAPT干预的LECs和与LNCs共培养的LECs中表达相同。LECs的Notch信号被DAPT抑制后,Ki67表达显著下降;LECs的Notch信号被Jagged1激活后,Ki67表达显著增加;Ki67在DAPT干预的LECs组和与LNCs共培养的LECs中表达相同。结论:大鼠LNCs主要通过抑制Notch信号通路在体外阻止LESCs的分化和增殖,对Notch信号通路的调控有望应用于角膜缘上皮细胞的组织工程。