肺炎克雷伯氏菌是重要的条件致病菌,可导致林麝肺炎,从而引起死亡。肺炎克雷伯氏菌中的LysR型转录调控因子可参与调控其毒力、分解代谢、耐药性等。本研究通过构建林麝源肺炎克雷伯氏菌GPKP中新发现的LysR型转录调控基因的缺失株及回补株,比较三者的生长曲线、药敏试验、生物被膜、抗逆性、细菌半数致死量、定殖能力及其引起的器官病理形态学等生物学特性的差异,探究该转录调控因子的基本功能,主要试验结果如下:1.林麝源肺炎克雷伯氏菌基因kp05372缺失株及回补株的构建:扩增基因kp05372上下游同源臂,交叠PCR获得融合片段,以pLP12T质粒为载体,通过无缝克隆连接,成功构建重组自杀质粒。通过接合转移,在氯霉素压力正向筛选及阿拉伯糖诱导反向筛选下,经两次同源重组,最终成功筛选到缺失株GPKP-△kp05372。以质粒pBAD33为载体克隆连接敲除基因片段kp05372,成功构建回补表达质粒pBAD33-KP。通过接合转移,阿拉伯糖诱导调节基因表达量,成功筛选到回补株GPKP-△kp05372⁺。2.林麝源肺炎克雷伯氏菌生物学特性分析:三株菌生长速率无显著差异,均表现为2 h后迅速增长,12 h达到最大,持续至18 h后,活菌量逐渐下降;野生株及回补株生物被膜形成能力强于缺失株;缺失株对头孢噻吩、复方新诺明及多粘菌素B产生了耐药性,对庆大霉素、氧氟沙星等的抑菌圈直径缩小5 mm以上,对新霉素的抑菌圈直径则增大5 mm以上;三株菌在不同的渗透压、温度、盐含量及过氧化氢浓度下无显著变化。在pH=2-7范围内,随pH值升高,缺失株耐酸能力逐渐下降;野生株、缺失株及回补株对小鼠的半数致死量分别为6.3×10⁷ CFU/mL、1.1×10¹⁰ CFU/mL、4.88×10⁹ CFU/mL;肝脏中三株菌的含量下降后保持稳定定殖,心脏、脾脏、肾脏及肠道中缺失株含量最先下降为0,定殖能力最弱;三株菌均能引起肝、肺的严重组织病理变化。综上所述,本研究成功构建GPKP基因缺失株GPKP-△kp05372及回补株GPKP-△kp05372⁺。比较生物学特性差异发现该基因缺失导致GPKP生物被膜形成能力下降,耐药性发生变化,毒力下降,还可能参与调控GPKP的抗酸性机制。为进一步研究LysR型转录调控因子GPKP基因kp05372的调控机制做铺垫。