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炭疽是一种由炭疽芽胞杆菌引起的人畜共患、高致死性传染病。自然情况下,病原菌主要感染牛、羊等家畜造成农牧业的损失,感染人的几率较低。然而,炭疽芽胞易于生产和释放、难以杀灭等特点使其成为恐怖袭击和生物战争中的首选生物武器,由此引发的炭疽病不仅剥夺无辜者的生命,更引起巨大的社会恐慌。因此,研究炭疽致病机理,开发炭疽诊断技术和防治策略,不仅是畜牧业健康发展的需求,长远来看,更是维护国家生物安全的战略需求。炭疽芽胞杆菌的致病因子包括由聚γ谷氨酸组成的外荚膜和细菌毒素。细菌毒素是起主导作用的毒力因子,属于AB型的二元毒素,其组成包括B成份保护性抗原(PA)和A成份水肿因子(EF)及致死因子(LF)。PA的功能是识别并结合特异细胞表面受体,并介导转运LF/EF到细胞内。LF是一种锌离子依赖型的金属蛋白酶,能够特异性地切割有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)。EF是一种钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶,能催化ATP形成cAMP。在体内,LF/EF在PA的介导下被转运到胞质内,修饰相应的底物。LF和EF的联合作用最终导致患者出现系统的炭疽症状直至死亡。本研究通过体外分子进化技术,筛选具有显性抑制活性的PA突变体,并在此基础上解析PA的结构与功能,同时开发新型的炭疽毒素抑制剂和更高效安全的炭疽疫苗。主要研究内容和结果概括如下：1.炭疽水肿因子的重组表达,纯化与活性分析本研究首先将编码EF的基因cya克隆到表达载体pGEX-6p-1上,以E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL为表达宿主菌,28℃条件下,用0.2 mM IPTG诱导6小时,发现EF主要以可溶的形式表达,这为在非变性条件下纯化EF提供了条件。进一步的利用还原性谷胱甘肽亲和树脂纯化了EF, SDS-PAGE分析表明获得的EF纯度较高。环腺苷酸(cAMP)分析表明,当用水肿毒素(EdTx:1μg/mLPA+1μg/mLEF)处理CHO-K1细胞后,胞内的cAMP相对于未处理的细胞提高了300倍,表明本纯化的EF具有很好的生物活性。2.保护性抗原的体外分子进化与显性抑制突变体的筛选鉴定PA对LF/EF的运输能力依赖于七聚体(prepore)和跨膜通道(pore)的形成。有研究表明,PA某些位点的突变子仍能够与野生型PA聚合形成prepore,但这种prepore不能形成具有运输功能的pore。我们将这种能够抑制野生型PA功能的突变体定义为显性抑制(dominant-negative, DN)突变体。本研究通过体外分子进化技术获得了得到了四个新的DN突变体：V377E,T380S,I432C和N435C。体外功能分析表明,这四个突变体不影响PA的激活,PA与LF的结合和prepore的形成,但能够阻断prepore形成pore,这表明氨基酸残基V377,T380,I432和N435在PAprepore向pore转化过程中发挥了关键作用。体外显性抑制活性检测表明,当四个突变体(mPA)与野生型PA (wPA)的剂量比高于2：1时,能够完全抑制致死毒素(LeTx)对RAW 264.7细胞的毒杀作用；其中V377E和N435C表现出较高的毒素抑制活性,当V377E或N435C与PA的比例为1：1时,即可完全抑制LeTx的细胞毒性。小鼠保护试验表明,将与PA等量的V377E或N435C和5×LD50的LeTx混合后静脉注射小鼠BALB/c,小鼠能够完全存活,说明V377E或N435C在体内也具有很好的抗毒素活性。这些新的DN突变体不仅可以作为一种潜在的抗毒素药物进行深入地开发,同时也为更透彻地解析PA的结构与功能提供了信息。3一种单成份炭疽双靶点抗毒素和三价疫苗的构建和评估PA与细胞表面受体结合后首先被弗林类蛋白酶切割激活释放N端20kDa的片段(PA20),剩余C端63 kDa的片段(PA63)形成多聚体并负责转运LF或EF至细胞内。本研究首先将能干扰炭疽毒素复合体形成的致死因子结合功能域(LFn)与PA融合形成LFn-PA,体外细胞毒性分析表明LFn-PA能够被furin酶切激活形成有功能的LFn-PA20和PA63,其中LF-PA20能够抑制LF与PA63的结合,进而抑制PA63介导的细胞毒性。在此基础上,结合之前的报道：显性抑制突变体(DPA)激活后形成的DPA63能够掺入到野生型PA63形成杂合七聚体并阻断野生型PA63对LF或EF的转运,我们将具有显性抑制活性的PA突变体F427D融合到LFn的C端形成LFn-DPA。细胞水平抗毒素活性分析表明,LFn-DPA对致死毒素抑制活性相对于DPA高出3倍,其对应的半抑制浓度(IC50)分别是0.4 nM和1.3 nM；对水肿毒素的抑制活性相对于DPA高出2倍,其IC50分别是4.1 nM和8.3 nM。体内试验表明LFn-DPA能够完全保护BALB/c小鼠免遭5×LD50炭疽致死毒素的攻击。此外,我们对LFn-DPA作为炭疽疫苗应用的潜力做了初步的评估。结果表明,相对于野生型的PA, LFn-DPA能够激发机体产生更强的抗PA的抗体反应。同时,LFn-DPA能够激发机体产生抗LF和EF的抗体,而PA不具备此免疫特性。攻毒试验表明LFn-DPA免疫后的小鼠能够完全存活下来。因此,LFn-DPA也可以作为一种更安全高效炭疽三价疫苗。本研究首次开发了一种单成份双靶点抗毒素,并证实该抗毒素也可作为一种三价的炭疽疫苗,这为联合炭疽治疗和预防提供了思路。