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目的:研究阻断OX40/OX40L通路联合ECDI结合供体脾细胞(ECDI-SPs)能否协同诱导预致敏小鼠心脏移植免疫耐受,并探讨其作用机制,为临床诱导预致敏受者免疫耐受提供新的方法。方法:(1)通过皮肤移植(BALB/c→C57BL/6)使小鼠致敏,在受体小鼠致敏6周后行心脏移植建立(BALB/c→C57BL/6)预致敏小鼠心脏移植模型。(2)实验分为空白对照组、单独ECDI-SPs组、单独抗OX40L抗体组、ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组,并设置单独IgG对照组、ECDI-SPs联合IgG对照组,共6个分组(n=5-6)。(3)根据实验分组,于受体小鼠于心脏移植术前7天、手术当天和术后第7、14天(d-7、d0、d7、d14)通过阴茎背静脉予输注1×10~8 ECDI-SPs;在心脏移植术当天至术后第10天(d0-d10),每天腹腔注射抗OX40L抗体(0.5 mg/只),IgG给药方法与抗OX40L抗体一致。术后每天触诊移植心脏,以移植心脏停跳定义为排斥时间点并记录移植心脏存活时间。(4)对联合处理组小鼠,即ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组小鼠,于心脏移植术前2天、手术当天及术后第2天(d-2、d0、d2)腹腔注射抗CD25抗体(0.5mg/只),同时使用IgG(0.5mg/只)作为对照,给药方法与抗CD25抗体一致,比较两组小鼠移植心脏存活时间和Tregs比例。(5)对ECDI-SPs联合抗OX40L抗体组小鼠,在心脏移植术后第30、100天(d30、d100)分别过继输注供体小鼠(BALB/c)预致敏和第三方供体小鼠(C3H)预致敏的受体小鼠(C57BL/6)脾脏来源的纯化T细胞(5×10~6;纯度>97%),比较两组小鼠移植心脏存活时间和Tregs比例。(6)流式细胞术检测各实验组小鼠脾脏中记忆性T细胞(包括CD4~+CD44~+Tms,CD8~+CD44~+Tms)和调节性T细胞(CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs)的比例。(7)体外混合淋巴细胞反应实验:提取各实验组受体小鼠脾脏CD11c~+DC细胞作为刺激细胞,供体小鼠脾脏CD3~+T细胞作为反应细胞,将刺激细胞以2.5×10~4/well密度、反应细胞以1×10~5/well密度进行混合培养(刺激细胞和反应细胞比例为1:4),培养96小时后收集细胞用于检测各组小鼠T细胞增殖程度。(8)HE染色观察移植心脏病理改变情况,通过ELISA方法检测各组小鼠血清中炎症细胞因子(IFN-γ和IL-6)的水平。结果:(1)小鼠经皮肤移植预致敏后体内脾脏中Tms比例小幅升高,当行心脏移植后Tms比例显著升高,最高可达50%以上;而采用抗OX40L抗体阻断OX40/OX40L通路后可同时抑制预致敏小鼠和预致敏行心脏移植小鼠Tms的扩增。(2)与对照组相比,单独ECDI-SPs组和单独抗OX40L抗体组均可显著延长预致敏小鼠移植心脏存活时间,其平均存活时间分别约为25天和38天,而ECDI-SPs+抗OX40L抗体组可诱导66.7%预致敏小鼠移植心脏长期存活(>100天)。(3)与对照组、单独ECDI-SPs组和单独抗OX40L抗体组相比,ECDI-SPs+抗OX40L抗体组可显著减轻移植心脏病理损伤和减少炎症细胞浸润,抑制Tms扩增,抑制血清中促炎症因子IFN-γ和IL-6释放,上调脾脏中CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs百分比,降低外周血中抗供体抗体水平。(4)在体外MLR实验中,对照组中T细胞被DC细胞刺激后显著增殖;单独使用抗OX40L抗体组和单独使用ECDI-SPs组的T细胞的增殖水平明显低于对照组;而ECDI-SPs+抗OX40L抗体组的T细胞的增殖水平最低,直到术后第100天仍维持在低水平。(5)在ECDI-SPs+抗OX40L抗体组中,围手术期通过注射抗CD25抗体清除受体小鼠体内的Tregs可阻断已建立的移植免疫耐受;(6)在ECDI-SPs+抗OX40L抗体组中,过继输注供体来源T细胞可抑制Tregs扩增并破坏已存在的免疫耐受,而输注第三方供体来源T细胞未能打破免疫耐受,因此推测ECDI-SPs+抗OX40L抗体诱导的免疫耐受具有供体特异性。结论:阻断OX40/OX40L通路联合ECDI-SPs可通过共同诱导调节性T细胞产生和扩增、抑制记忆性T细胞分化和扩增、抑制促炎症因子的释放、降低抗供体抗体水平,从而诱导预致敏小鼠心脏移植物的长期存活,并获得供体特异性免疫耐受。