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目的肿瘤坏死因子-a (Tumor Necrosis Factor, TNF-a)是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子,是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。在前期的研究中发现,TNF-a能够诱导小鼠黑色素瘤B16细胞发生自体吞噬,但是其是否能够诱导小鼠黑色素瘤细胞B16和B16F10细胞发生衰老目前尚不清楚。因此,本研究旨在探讨TNF-a是否能够诱导小鼠黑色素瘤细胞发生衰老及其诱导细胞衰老的作用机制。方法1.体外培养小鼠黑色素瘤B16和B16F10细胞,根据处理方法的不同分为3组：对照组、TNF-a处理组(20ng/ml TNF-a处理12h、24h、48h)、3-MA+TNF-a处理组(10mmol/L3-MA预处理2h,20ng/ml TNF-a处理12h、24h、48h)。2.相差显微镜观察油红O染色后TNF-a处理不同时间点B16细胞内脂滴数量的变化。3.流式细胞术(FCM)检测TNF-a处理不同时间点B16和B16F10细胞周期G1/Go期百分比的变化。4.收取不同处理组的B16和B16F10细胞,提取细胞总RNA,聚合酶链式反应(PCR)检测衰老相关基因p16、p21、p53、CDK2、CDK4、CyclinD. CyclinE、 Rb、E2F-1mRNA的表达变化。5.收取不同处理组的B16细胞,RIPA裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测细胞衰老相关蛋白p53、成视网膜细胞瘤基因Rb磷酸化水平的变化、细胞周期相关转录因子E2F-1和Ras-Raf-MAPK信号通路上关键蛋白K-Ras、磷酸化Erk、NF-κB的表达变化。以及自噬标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬性死亡标志蛋白Beclin1在B16F10细胞中的表达变化。结果1.与对照组相比,TNF-a处理24h后B16细胞内有少量脂滴出现,TNF-a处理48h后B16细胞内出现大量的脂滴,具有明显的时效关系；2.与对照组相比,TNF-a处理48h后B16细胞G1/G0期所占百分比显著升高,3MA+TNF-a处理组的B16细胞G1/G0期的百分比高于TNF-a处理组；与对照组相比,TNF-a处理后B16F10细胞G1/G0期所占百分比显著升高,且具有明显的时效关系；3.在正常小鼠黑色素细胞mela细胞中,能够检测到p16基因,而黑色素瘤细胞B16和B16F10细胞中未检测到p16基因；4.与对照组相比,TNF-a处理12h后B16细胞内衰老标志性基因p21mRNA的表达变化不明显,p53mRNA的表达显著升高；3MA+TNF-a处理12h后B16细胞中p21、p53mRNA的表达水平较TNF-a处理组升高；5.与对照组相比,TNF-a处理组B16细胞中p21、p53的下游关键基因CyclinE、 E2F-1mRNA的表达水平显著降低,Rb mRNA的表达水平显著升高；6.与对照组相比,经TNF-a处理后的B16F10细胞中p21mRNA的表达变化不明显,p53mRNA的表达水平显著升高,到48h B16F10细胞内p53mRNA的表达下降至初始水平；7.与对照组相比,TNF-a处理的B16F10细胞中p21、p53的下游关键基因CDK2、CDK4、CyclinE、E2F-1mRNA的表达水平显著下降；CyclinD mRNA的表达水平在24h时显著升高,到48h时下降；Rb mRNA的表达变化不明显；8.与对照组相比,TNF-a处理组B16F10细胞内LC3、Beclinl的表达升高且高于3-MA+TNF-a处理组；9.与对照组相比,3-MA+TNF-a处理组B16细胞中p53蛋白的表达水平显著升高,且高于TNF-a处理组；10.与对照组相比,TNF-a处理组与3-MA+TNF-a处理组B16细胞RB蛋白的磷酸化水平显著下降；11.与对照组相比,TNF-a处理12h后B16细胞内E2F-1蛋白的表达下降,24h时E2F-1蛋白的表达上升至初始水平；12.与对照组相比,TNF-a处理后B16细胞内Ras-Raf-MAPK信号通路上的关键蛋白K-Ras和pErk的表达显著升高,3-MA+TNF-a处理组B16细胞中K-Ras蛋白和Erk蛋白的磷酸化水平高于TNF-a处理组；13.与对照组相比,TNF-a处理后B16细胞内NF-κB的表达水平显著升高,3-MA+TNF-a处理组B16细胞中NF-κB的表达水平高于TNF-a处理组。结论1. TNF-a除了能够诱导小鼠黑色素瘤B16F10细胞发生自体吞噬,还能够诱导小鼠黑色素瘤细胞B16和B16F10细胞发生衰老。2. TNF-a可能通过自体吞噬诱导小鼠黑色素瘤细胞发生衰老,且适度的自噬能够延缓小鼠黑色素瘤细胞衰老。3. TNF-a通过Ras-Raf-MAPK和P53-P21-Rb信号通路诱导B16细胞发生衰老。4. NF-κB可能在B16细胞衰老过程具有重要的调控作用。5.小鼠黑色素瘤细胞存在着p16基因的缺失。