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MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的长约21-25 nt的单链小RNA分子,普遍存在于各种生物中。miRNA可通过与其靶基因mRNA的特异性结合,引起靶基因mRNA的降解或抑制蛋白的合成,从而参与调节细胞的生命活动进程。miRNA功能研究通过对miRNA过表达或抑制,分析miRNA及其靶基因的表达和功能。查询miRNA数据库——miRBase得知,家蚕(Bombyx mori,Bmo)中已有大量的miRNAs序列被发现。序列同源性比对发现在其他物种中也存在大量miRNAs,其数量远未达到饱和。目前,已有大部分的miRNA通过生物信息学方法被发现,但对家蚕中miRNAs的功能研究相对较少。细胞自噬对生物体生长、发育、疾病发生与控制等都有着重要意义,但是在高等动物研究中还存在许多未知的领域。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物与哺乳动物基因组相比,家蚕基因组相对简单且个体较大,基因组全长为450 M左右,共有28对染色体,是研究昆虫变态发育的理想材料本研究以与家蚕自噬相关Bmo-miR-34为研究对象,根据生物信息学方法预测出该miRNA潜在的靶基因。首先通过双荧光素酶报告基因载体检测法检测Bmo-miR-34与其预测靶基因的互作;进而利用带有荧光标签的过表达载体和个体注射的方法分别在细胞水平和个体水平上检测miRNA被过表达或抑制后,对其预测靶基因表达和自噬发生的影响,揭示miRNA与其靶基因的互作关系,探索miRNA对家蚕自噬的调控机理,并为家蚕及其它疾病相关miRNAs的靶标验证及其功能研究建立有效的、通用的研究方法。通过将预测靶基因上与Bmo-miR-34互作的片断构建到psiCHECK2双荧光素酶报告载体上,与合成的Bmo-miR-34模拟物(mimics)和阴性对照(NC)共转染哺乳动物HEK293细胞系,用双荧光素酶报告基因载体检测法检测双荧光素酶活性。结果表明,Bmo-miR-34与自噬相关基因Atg1基因有互作,并且二者的互作可对Atg1基因起抑制作用。在BmN细胞中,采用溶酶体染色方法发现,由蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导的自噬在24 h内随着处理时间的延长,自噬随之增强。与20E 2 h相比6 h,12 h和24 h Atg1基因的表达量均升高,由此表明,20E可诱导Atg1基因的表达,并促进自噬的发生。同时过表达Bmo-miR-34后可抑制20E诱导的自噬,相反抑制Bmo-miR-34后可促进20E诱导的自噬。利用构建的带荧光标签蛋白的ATG8过表达载体转染BmN细胞结果表明,20E对自噬标志蛋白ATG8有促进作用,为进一步过表达Bmo-miR-34靶基因Atg1后对自噬的影响奠定了基础。在家蚕个体内注射agomir或antagomir对Bmo-miR-34进行过表达或抑制,结果表明,在脂肪体中Bmo-miR-34的过表达能抑制自噬,Bmo-miR-34的抑制可促进自噬。综上所述,研究结果表明Bmo-miR-34可通过调控自噬蛋白ATG1的表达在家蚕自噬过程中发挥作用。