壳聚糖及烷基化壳聚糖/DNA复合物介导的基因转染研究

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本文主要研究了壳聚糖及烷基化壳聚糖/DNA聚电解质复合物的性质以及此复合物介导的基因转染,主要内容包括以下三个方面:以多种手段对壳聚糖及其烷基化衍生物/DNA复合物进行研究。通过红外光谱、31P NMR谱、圆二色谱和荧光光谱的分析得知,DNA在与壳聚糖形成聚电解质复合物时只是引起DNA价键的微小扰动,DNA仍保持B型构象,部分壳聚糖结合到DNA的小沟区域。对CS/DNA复合物的AFM的观测表明,壳聚糖/DNA复合物的拓扑结构因电荷比的不同而异,在低壳聚糖/DNA电荷比时,仍然存在自由DNA,较高电荷比下,可形成纳米尺度的颗粒。以二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)为模拟细胞膜,通过原子力显微镜和差示扫描量热法(DSC)测定烷基化壳聚糖与模拟胞膜的相互作用,探索载体的跨细胞膜机制。结果表明,壳聚糖和烷基化壳聚糖均能够引起DPPC膜的扰动。对于烷基化壳聚糖,随着疏水性的提高,膜扰动效应增强。复合物的电泳分析和DNase降解实验揭示,与壳聚糖相比,少量的烷基化壳聚糖可与DNA形成复合物,且同样起到保护DNA免受酶解的作用。以C2C12小鼠成肌细胞为宿主细胞,以壳聚糖和烷基化壳聚糖为载体,介导含CAT报告基因的转染,通过细胞酶联免疫吸附实验(ELISA)测定表达CAT的含量以确定基因转染效率,考察疏水烷基链的引入对转染率的影响。结果表明,壳聚糖和烷基化壳聚糖可成功地将pcDNA3.1/CAT质粒转入C2C12细胞内,壳聚糖基载体的转染率比裸DNA转染率高4倍,而烷基化壳聚糖的转染率随着烷基链的延长进一步提高,当烷基测链碳原子数为8时,转染率趋于稳定。 克隆IGF-Ⅰ成熟肽编码基因、含信号肽编码序列的IGF-Ⅰ基因,并讨论了有关转IGF-Ⅰ基因对细胞增殖作用。通过在荧光显微镜下的观测,证明质粒DNA可被导入C2C12细胞,并且其所携带的基因可在受体细胞中有效的表达。所筛选出的稳定转染细胞系在增殖速度上高于未转染的C2C12细胞。
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