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昼夜节律系统正常功能的维持在各个生命领域都是不可或缺的。出现于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)早期的昼夜节律紊乱(Circadian rhythm disorder,CRD),严重影响患者生活质量并可加重AD的发生发展,故寻找针对AD昼夜节律紊乱的治疗手段意义重大。β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)在近年来被认为与AD昼夜节律紊乱的形成关系密切。研究发现,2型糖尿病和AD在病理表现和发病机制中存在诸多相似性,这可能为AD的治疗提供了新的探索方向。胃泌酸调节素(Oxyntomodulin,OXM)作为体内天然的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)/胰高血糖素双受体激动剂,是一种新型糖尿病治疗药物,目前OXM类似物D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)的神经保护作用已经逐渐被证实且其在脑中发挥效应主要依赖于GLP-1受体的活化。但Oxy对AD昼夜节律紊乱是否也有改善作用尚不明确。本研究在动物水平通过小鼠自主跑轮行为学实验和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)实验首次证实Oxy对Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱和海马生物钟基因Bmal1和Per2异常表达具有改善作用,在离体水平证实Oxy以剂量依赖的方式拮抗Aβ31-35对小鼠海马HT22神经细胞系的毒性作用,同时使用Real-time PCR和Western Blot实验明确Oxy可显著改善Aβ31-35所致HT22细胞内生物钟基因Bmal1和Per2异常表达。使用慢病毒干扰GLP-1受体基因后发现,GLP-1受体基因沉默可诱导生物钟基因Bmal1和Per2异常表达,且此时Oxy无法继续发挥神经保护作用。以上结果表明Oxy可显著改善Aβ31-35所致昼夜节律紊乱和生物钟基因异常表达,且GLP-1受体在Oxy发挥改善效应过程中起着重要作用,这为AD患者昼夜节律紊乱的防治提供了新的思路和实验支持。第一部分Aβ31-35诱导昼夜节律紊乱及生物钟基因表达异常目的:验证Aβ31-35可诱导小鼠昼夜节律紊乱的发生、小鼠海马内生物钟基因的异常表达及小鼠海马HT22细胞生物钟基因的异常表达。方法:将6-8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为2组:Control组、Aβ31-35组。应用跑轮行为学实验观察小鼠的昼夜跑轮节律活动,检测小鼠运动活性、自由运转周期和昼/夜活动量变化。使用Real-time PCR检测小鼠海马内生物钟基因Bmal1和Per2的节律性变化。选取小鼠海马HT22神经细胞系并分为Control组和Aβ31-35组,用CCK-8细胞毒性实验检测Aβ31-35为2.5,5和10μM时细胞存活率,Real-time PCR和Western Blot检测Aβ31-35剂量为5μM时HT22细胞生物钟基因在不同时间点表达水平改变。结果:(1)与Control组相比,Aβ31-35组小鼠的跑轮活动较为散乱,每日睡眠-运动模式无规律,运动活性降低、自由运转周期延长及小鼠主观白天活动量增加。(2)与Control组相比,Aβ31-35组小鼠海马生物钟基因Bmal1和Per2 mRNA表达出现相位延迟,分别在CT20和CT16时间点表达水平明显降低。(3)2.5,5和10μM Aβ31-35可致HT22细胞存活率显著降低,与Control组相比均有统计学差异。(4)与Control组相比,Aβ31-35组HT22细胞内Bmal1和Per2出现异常表达,分别在CT20和CT16时间点出现mRNA和蛋白表达水平的明显降低。结论:Aβ31-35可以诱导小鼠昼夜节律紊乱及生物钟基因Bmal1和Per2表达异常。第二部分D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)改善Aβ31-35所致昼夜节律紊乱及生物钟基因表达异常目的:验证D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)对Aβ31-35所致小鼠昼夜节律紊乱、小鼠海马内生物钟基因的异常表达及小鼠海马HT22细胞生物钟基因的异常表达的改善作用。方法:将6-8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:Control组、Aβ31-35组、Oxy预处理组(Oxy+Aβ31-35组)及Oxy单独给药组(Oxy组),应用跑轮行为学实验观察各组小鼠的昼夜跑轮运动节律,检测小鼠运动活性、自由运转周期和昼/夜活动量变化。使用Real-time PCR检测小鼠海马内Bmal1和Per2的节律性变化。选取小鼠海马HT22神经细胞系也分为以上四组,CCK-8法检测Oxy对细胞存活率影响,Real-time PCR和Western Blot检测Oxy对Bmal1和Per2异常表达的作用。结果:(1)与Aβ31-35组小鼠相比,Oxy预处理组小鼠跑轮活动较为规律,每日睡眠-运动的模式较为固定,运动活性升高,自由运转周期缩短,主管白天活动量相对减少。(2)与Aβ31-35组相比,Oxy预处理组小鼠海马内生物钟基因Bmal1和Per2 mRNA表达相位的延迟有所恢复,表达水平分别在CT20和CT16显著提高。(3)1,10,100,200 nM Oxy预处理均可改善Aβ31-35所致HT22细胞存活率的降低,其中100和200 nM剂量可致细胞存活率显著提高,与5μM Aβ31-35组相比有统计学差异。(4)与Aβ31-35组相比,Oxy预处理组HT22细胞内Bmal1和Per2 mRNA和蛋白的异常表达得到改善,表现为表达水平分别在CT20和CT16显著提高。结论:Oxy对Aβ31-35所致昼夜节律紊乱及生物钟基因Bmal1和Per2表达异常具有改善作用。第三部分GLP-1受体参与Oxy改善Aβ31-35所致HT22细胞生物钟基因异常表达目的:观察GLP-1受体基因沉默后对HT22细胞内生物钟基因表达的影响,观察此时Oxy对Aβ31-35所致生物钟基因异常表达是否仍具有改善作用。方法:首先使用含GLP-1R-shRNA-GFP的慢病毒质粒对HT22细胞进行感染,镜下观察感染效率,并使用Real-time PCR和Western Blot检验沉默效率。将GLP-1R基因沉默的HT22细胞分为四组:慢病毒组(LV-shGLP-1R组)、慢病毒+Aβ31-35组(LV-shGLP-1R+Aβ31-35组)、慢病毒+Oxy+Aβ31-35组(LV-shGLP-1R+Oxy+Aβ31-35组)和慢病毒+Oxy组(LV-shGLP-1R+Oxy组)。同时将未经感染的HT22细胞作为Control组,Real-time PCR检测各组在CT4、CT8、CT12、CT16、CT20和CT24共6个不同时间点细胞内生物钟基因Bmal1和Per2的节律性表达。结果:(1)与Control组相比,LV-shGLP-1R组细胞内生物钟基因Bmal1和Per2表达水平在各个时间点均有所下降。(2)与LV-shGLP-1R+Aβ31-35组相比,LV-shGLP-1R+Oxy+Aβ31-35组细胞内Bmal1和Per2的异常节律性表达无明显改善。结论:GLP-1受体基因沉默诱导HT22细胞生物钟基因Bmal1和Per2的表达水平降低,且GLP-1R基因沉默后,Oxy无法改善Aβ31-35在HT22细胞内诱导的Bmal1和Per2异常表达。