论文部分内容阅读
研究背景原发性肝癌(Primary hepatic cancer,PHC)包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌三种病理类型,其中HCC占原发性肝癌的75%-85%。2018年全球肿瘤流行病学数据表明:肝癌年新发患者84.1万例,年死亡人数78.2万例。我国肝癌的发病人数占全世界的55%,国内肝癌的发病率位居所有癌症第四,死亡率位居第三,肝癌高发病率与死亡率给社会造成重大的经济负担。尽管肝癌的诊断和治疗水平不断地提高,但常规治疗手段的治疗效果目前仍无突破性进展。近年来,随着人们对肝癌的细胞生物学研究的深入,高稳定性、特异性的分子靶向正成为研究的热点。趋化素样因子超家族最早是由我国学者团队发现并报道的一种新型基因家族,科学家们利用抑制性减数杂交技术发现了趋化素样因子1(CKLF1),并将CKLF1的3种变异体分别命名为CKLF2、3、4。后在此基础上,先后成功克隆并验证了CKLFSF1-8,2005年国际上证实命名为CMTM1-8。该超家族基因有着共同的MARVEL结构,这些结构特点赋予了CMTM家族特有的功能,并参与了免疫、生殖、造血、心肌、骨骼等多个系统的调控。其中CMTM1、3、5、7、8基因的编码产物目前被认为具有潜在的抑癌基因作用。CMTM7作为CMTM家族成员之一,在人体组织中广泛表达,表达产物的结构及其功能介于四次跨膜蛋白和典型的趋化因子之间,四次跨膜蛋白在体内通过结合其他多种蛋白而发挥作用,参与细胞的分化、粘附、溶解、信号传导等生物学特性的过程。有研究表明,在非小细胞肺癌组织中,CMTM7表达远远低于相对应的癌旁组织,而干扰CMTM7表达后,能够显著抑制肿瘤细胞的凋亡。另外,也有文献报道,过表达CMTM7可降低表皮生长因子受体的稳定性,加快其降解和促进内化。以上研究提示,CMTM7可能在肿瘤发生发展中发挥着重要的意义。在本课题中,我们将重点探讨CMTM7在HCC中的功能及其机制。实验目的1.通过收集HCC肿瘤组织样本及HCC细胞系,检测CMTM7在HCC中的表达情况。同时通过分析CMTM7在HCC组织中的表达水平与患者临床数据、随访结果,分析CMTM7与HCC患者病理特征、预后的相关性。2.在HCC细胞中过表达CMTM7后,检测是否能够影响HCC细胞的生长、迁移。3.检测在HCC细胞中过表达CMTM7后是否能够影响HCC细胞周期进程。4.通过构建肿瘤异体移植模型,检测过表达CMTM7是否能够影响HCC肿瘤的生长。5.在HCC细胞中过表达CMTM7后,检测CMTM7是否能够影响STAT3驱动的荧光素酶活性、STAT3的活化水平。6.通过建立索拉非尼HCC耐药株,检测CMTM7在耐药株中表达及过表达CMTM7对耐药株耐药性的影响。实验方法1.利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹法(western blot)技术检测HCC肿瘤组织及HCC细胞系中CMTM7的表达水平。2.利用免疫组化技术(IHC)检测HCC肿瘤组织及癌旁正常组织中CMTM7的表达水平,并通过IHC获得的肿瘤组织CMTM7表达积分,统计分析积分与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。3.利用Lipofectamine(?)2000在HCC细胞中转染CMTM7过表达质粒。4.利用Cell Counting Kit-8法(CCK-8)检测HCC的细胞存活情况。5.利用细胞划痕、Transwell实验检测过表达CMTM7对细胞迁移能力的影响。6.利用流式分析及western blot技术检测过表达CMTM7后对HCC细胞周期的影响。7.利用构建的裸鼠肿瘤异体移植模型检测CMTM7对HCC肿瘤生长的影响。8.利用荧光素酶报告基因及western blot技术检测过表达CMTM7对STAT3活化的影响。9.利用western blot及CCK-8检测索拉非尼HCC耐药株中CMTM7的表达及过表达CMTM7对耐药株药物敏感性的影响。实验结果1.利用qRT-PCR法检测发现,相对于HCC癌旁正常组织,CMTM7在HCC肿瘤组织中的表达水平明显下降,其中78.8%(41/52)的HCC肿瘤组织中CMTM7的mRNA表达下调,肿瘤与癌旁组织之间的mRNA及蛋白表达水平差异具有统计学意义(p<0.01)。同时,CMTM7在4种HCC细胞系中的mRNA表达水平较正常肝脏上皮细胞系QSG7701表达水平也显著下降,差异具有统计学意义(p<0.01)。2.IHC结果提示,CMTM7的免疫组化积分在患者性别、年龄、肝脏纤维化、乙肝表抗阳性及远处转移等因素中,差异均无统计学意义(p>0.05),而在肿瘤的不同临床分期中,差异有统计学意义(p＜0.01),CMTM7的免疫组化积分与临床肿瘤分期呈负相关(R=-0.771)。另外,CMTM7低表达组患者5年生存率较高表达组显著下降(p=0.03 8)。3.CCK-8检测发现,过表达CMTM7能够显著抑制HCC细胞的生长。4.细胞划痕实验显示,划痕后24小时和48小时节点上,过表达CMTM7后较空载质粒组、阴性对照组HCC细胞迁移力差异有统计学意义(均P<0.01)。另外,Transwell小室法测定细胞的侵袭力结果表明,空载质粒转染组与阴性对照组细胞穿膜数量差异无统计学意义(p=0.33),而过表达CMTM7组较阴性对照组明显减少,差异有统计学意义(p<0.01)。5.流式细胞分析发现,过表达CMTM7能够使HCC细胞周期阻滞在G0/G1期。并且通过对细胞周期蛋白分析发现,相对于空载质粒转染组,过表达CMTM7组中HCC细胞内的CyclinD1、CDK4、CDK6表达水平均下调,而p27表达水平上调。6.裸鼠肿瘤异体移植模型发现,过表达CMTM7能够显著抑制裸鼠皮下HCC异种移植瘤的生长。7.荧光素酶报告基因检测发现,过表达CMTM7能够显著抑制STAT3驱动的荧光素酶的活性。另外,western blot结果显示,过表达CMTM7能够显著抑制HCC细胞中STAT3的活化水平。8.在索拉非尼HCC耐药株中发现,CMTM7存在低表达,而过表达CMTM7能够显著增强耐药株对索拉非尼的药物敏感性。结论1.CMTM7在HCC肿瘤组织及细胞系中低表达,并与HCC病人的预后密切相关。2.过表达CMTM7抑制HCC细胞的生长、迁移能力,通过阻滞细胞周期于G0/G1期来影响细胞的生长。3.过表达CMTM7通过上调SHP-1的表达来抑制HCC细胞中STAT3信号通路。4.过表达CMTM7能够增强索拉非尼HCC耐药株对索拉非尼的药物敏感性。5.CMTM7基因有望作为HCC新的预后指标或索拉非尼的疗效预测指标。