肾细胞癌作为肾癌最常见的亚型,对放疗、化疗均不敏感,早期局限性肾细胞癌以手术切除为主。30%的患者被确诊为肾细胞癌时已经发生转移,并且一部分患者术后仍会发生转移,转移性肾细胞癌患者预后极差。目前分子靶向药物治疗肾细胞癌取得了一定的进展,但疗效并不令人满意,因此发展新的药物具有重要的临床意义。自然化合物是新的药物发展的宝贵资源,白藜芦醇(Resveratrol,Res)作为一种天然类化合物,分布于多种植物中。已有的研究显示Res能够通过引起细胞周期阻滞,诱导凋亡,抑制侵袭、转移等多种机制,对多种类型的肿瘤细胞体外具有抑制作用,并且在体内同样具有抗肿瘤活性。目前Res在肾细胞癌中的相关研究较少,并且由于Res复杂的药理活性,其作用机制尚不清楚。本研究观察Res对肾细胞癌的作用,并探讨相关的作用机制,为发展新的药物治疗肾细胞癌提供理论基础。第一部分白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用背景:研究显示Res对多种类型的肿瘤具有抑制作用,但在肾细胞癌中的作用目前研究较少,需进一步阐释。目的:探讨Res对人肾细胞癌的作用。方法:给予Res处理人肾细胞癌786-O细胞,使用CCK8检测细胞活性;流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期;细胞划痕及transwell实验分析迁移及侵袭能力;Western blot检测MMP2(基质金属蛋白酶2)及MMP9(基质金属蛋白酶9)蛋白的表达;建立786-O细胞裸鼠移植肿瘤模型,观察Res体内对肾细胞癌生长的作用。结果:Res呈浓度及时间关系减少786-O细胞的活性。给予48 h的处理,20μM及40μM浓度的Res诱导细胞凋亡,10μM的Res对凋亡无明显影响,但引起S期周期阻滞。Res抑制786-O细胞的迁移及侵袭能力,并且下调MMP2及MMP9蛋白的表达。Res在裸鼠体内抑制移植肿瘤的生长,减少肿瘤的体积及重量。结论:Res在体外及体内对人肾细胞癌均具有抗肿瘤作用。第二部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:细胞凋亡是一个主动过程,涉及一系列信号因子的激活、表达以及调控。积累的证据证实Res能诱导肿瘤细胞的凋亡,但由于其复杂的药理活性,诱导凋亡的具体分子机制仍需进一步的阐释。目的:体外探讨Res诱导786-O细胞凋亡的分子机制。方法:流式细胞技术检测线粒体膜电位、凋亡、caspase3活性及ROS(活性氧)水平;免疫荧光检测ROS及细胞色素C;Western blot分析GAPDH、COXⅣ、细胞色素C、PARP、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38蛋白的表达。结果:Res下调786-O细胞的线粒体膜电位水平,促进细胞色素C的胞浆释放,上调caspase3活性,引起PARP蛋白的裂解。Z-VAD-FMK,一个pan-caspase抑制剂,显著抑制Res诱导的凋亡。进一步的实验显示Res促进786-O细胞ROS的产生,抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)能够改善线粒体膜电位,下调caspase3活性,减少PARP蛋白的裂解,抑制Res诱导的凋亡。最后我们发现Res通过ROS抑制ERK(细胞外信号调节激酶),激活JNK(c-jun氨基末端激酶)及p38(p38丝裂原活化蛋白激酶),SP600125(JNK抑制剂)对凋亡无明显影响,SB203580(p38抑制剂)减少Res诱导的786-O细胞凋亡。结论:1、Res引起线粒体损伤,激活caspase3导致786-O细胞凋亡。2、Res上调786-O细胞的ROS水平,升高的ROS促进凋亡。3、Res通过ROS激活p38,激活的p38促进Res诱导的786-O细胞凋亡。第三部分自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:自噬作为进化过程中的保守机制,普遍存在于各种生物细胞中。当细胞受到各种压力,能够激活自噬,维持内环境的稳态,有利于细胞在压力环境下的存活;但在一些情况下,极度的自噬能导致损伤的进一步加重,促进细胞的死亡。研究报道Res能通过多种途径影响自噬,发挥促存活或促死亡的作用,但在肾细胞癌中的作用并不清楚。目的:体外探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。方法:流式细胞技术及免疫荧光检测Cyto-ID荧光分析细胞自噬体形成;western blot检测GAPDH、LC3BII、P62、S6、p-S6、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK、BCL2、p-BCL2、Becline1以及PARP蛋白的表达;流式细胞技术检测细胞凋亡;si RNA干扰技术敲低Beclin1蛋白的表达,探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。结果:Res上调786-O细胞自噬水平;Res诱导的自噬需要ROS,抗氧化剂NAC减少Res上调的自噬;Res对p-AMPK及p-S6蛋白的表达没有影响,JNK阻滞剂SP600125下调自噬,相反p38阻滞剂SB203580进一步促进Res诱导的自噬;自噬阻滞剂CQ(氯喹)进一步促进Res诱导的凋亡,上调PARP蛋白的裂解,并且Beclin1si RNA上调Res引起的PARP蛋白的裂解。结论:1、Res在786-O细胞中激活自噬。2、Res通过ROS-JNK路径激活自噬。3、自噬抑制Res诱导的786-O细胞凋亡。第四部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老背景:细胞衰老是指细胞从生长状态进入不可逆转的生长停滞状态。在一定条件下,如化疗药物、电离辐射以及氧化损伤等因素可以诱导肿瘤细胞进入衰老。研究证实Res在体外能够诱导肿瘤细胞进入衰老,抑制肿瘤细胞的生长增殖,但是否能够引起肾细胞癌细胞的衰老迄今未见相关报道。目的:体外探讨Res对肾细胞癌786-O细胞衰老的影响。方法:流式细胞技术检测细胞周期,凋亡及ROS水平;免疫荧光分析p-H2AX;EDU增殖实验检测细胞增殖;SA-β-Gal染色检测细胞衰老;western blot检测GAPDH、p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1、p38、p-p38及p21蛋白的表达水平;荧光定量PCR检测IL-6、IL-8 mRNA的表达,ELISA分析IL-6、IL-8蛋白的分泌水平。结果:给予10μM的Res持续处理786-O细胞4 d,Res增加p-H2AX阳性的细胞,上调p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,引起持续的S期周期阻滞,减少EDU阳性的细胞,增加SA-β-Gal染色阳性的细胞,诱导786-O细胞衰老,未引起明显细胞凋亡。Res诱导786-O细胞衰老需要上调的ROS,NAC降低Res上调的p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,恢复细胞增殖,下调SA-β-Gal染色阳性的细胞。进一步来说,衰老的细胞上调IL-6、IL-8 mRNA以及蛋白分泌水平(衰老相关的分泌表型,SASP),上调的IL-6、IL-8mRNA及蛋白分泌需要ROS激活的p38活性,SB203580(p38阻滞剂)抑制IL-6、IL-8 mRNA及蛋白分泌水平。结论:1、Res在体外能够诱导786-O细胞衰老。2、Res上调的ROS促进786-O细胞衰老。3、Res通过ROS-p38路径促进SASP。