第一部分先天性颈椎融合畸形的临床特征及遗传学分析[研究背景]先天性颈椎融合畸形又称Klippel-Feil综合征(Klippel-Feil Syndrome,KFS),是一组以颈椎形成及分节障碍为特征的罕见疾病。KFS患者早期常无明显颈部疼痛及神经压迫症状,或仅因其它系统伴发畸形就诊而忽视颈椎病变,这为KFS的早期诊断与治疗带来极大挑战。随着疾病的进展,KFS患者易发生邻近颈椎节段不稳定、颈椎退行性病变等从而导致神经压迫症状;同时KFS患者可合并多种先天性疾病和其它系统畸形,严重影响患者的生活质量,甚至可造成严重的身心问题,给家庭和社会造成极大负担。因此,探索其发病机制、早期预测及诊断方法是当前KFS的研究热点。目前已经在人类家系中依次发现GDF6、MEOX1、GDF3、MYO18B、RIPPLY2等基因的突变均参与KFS的发病过程。虽然已有上述5个KFS致病基因的报道,但仅能解释极少数KFS的病例,KFS潜在的分子病因学机制尚不明确。在本研究中,我们将通过全外显子测序技术,运用核心家系结合散发病例的研究策略,探寻KFS的候选致病基因及相关机制,从而进一步扩大KFS的致病突变谱,为KFS的早期诊断及靶向治疗提供基础。[目的]本研究旨在以中国汉族人群KFS患者为研究对象,明确KFS患者的临床表型及影像学特征,在全外显子组水平寻找与KFS发生发展相关的基因突变,将得到的目的基因与KFS临床表型相结合,为预测疾病进展,指导临床干预提供理论依据。[研究方法]研究纳入于北京协和医院就诊,通过颈椎正侧位X线及颈椎CT平扫+三维重建检查明确诊断的KFS患者37例,收集并统计所有患者的人口学信息、临床表型、体格检查及影像学资料等。记录每位患者颈椎融合节段及椎体畸形,并根据Samartzis分型将患者分为KFS Ⅰ型(颈椎单节段融合)、Ⅱ型(颈椎非连续、多节段融合)及Ⅲ型(颈椎连续、多节段融合)。提取全部患者外周血样本DNA后进行全外显子测序研究,我们采用北京协和医院标准化注释流程对全外显子测序的原始数据进行注释。(1)将所有变异与公共遗传突变数据库进行比对,过滤掉正常人携带的常见突变及不影响基因功能的突变;(2)采用生物信息学工具预测候选基因突变的保守性和致病性;(3)以最小等位基因频率<0.001为标准对所有突变进行过滤,筛选出罕见突变;(4)基于与椎体分节不良相关的96个候选基因,对照北京协和医院534例无骨骼畸形样本的全外显子测序结果,采用罕见突变的负荷检验分析筛选出具有统计学差异、与KFS具有显著相关性的基因作为候选基因,并进行基因型表型关联分析。[结果]在入组的37例KFS患者中,男性20例、女性17例,平均年龄12.6±5.3岁。先天性颈椎椎体融合节段数平均为2.3个,最常见的融合节段分别为C6-C7、C2-C3和C3-C4。KFS典型的临床三联征包括短颈畸形、后发际线低和颈椎活动受限,我们的研究中颈椎活动受限最为常见(17例,45.9%),其次为短颈畸形(10例,27.0%)和后发际线低(6例,16.2%);43.2%的患者没有表现出临床三联征的任何典型表现;仅有10.8%的患者同时表现出全部三个典型体征。根据Samartzis分型,KFS Ⅲ型患者更易表现出短颈畸形和颈椎活动受限。伴发畸形方面,9例(24.3%)患者表现为椎管内畸形(脊髓空洞、脊髓纵裂和脊髓栓系等);12例(32.4%)患者合并其他系统畸形。在全外显子测序方面,我们首先关注已报道的5种KFS致病基因(GDF6、MEOX1、GDD3、MYO18BR和IPPLY2)的罕见突变,研究发现在MYO18B中具有三种致病性不明的新发突变。通过罕见突变的负荷检验分析,我们发现BAZ1B(P=0.00000002)与KFS具有最显著相关性,其次为FREM2(P=0.0003)、SUFU(P=0.0004)、VANGL1(P=0.0072)和KMT2D(P=0.0214)。此外,研究发现7名KFS患者具有多个候选基因的罕见突变,其频率显著高于对照组(P=0.00148),表明KFS可能存在寡基因遗传模式。[结论]本研究建立了目前已知较大样本量的KFS队列,总结中国汉族人群KFS患者的临床表型及影像学特点。研究表明长节段连续性颈椎融合畸形患者更易表现出短颈畸形、颈椎活动受限及临床三联征的表现,如未及时采取干预或治疗,可能会严重影响患者生活质量,因此在临床中更应引起关注和密切随访。本研究提出5种与KFS相关的候选致病基因,扩展了 KFS的已知基因突变谱,并提出寡基因遗传模式对KFS发生的影响,为进一步阐明KFS疾病的遗传背景提供基础。研究中新发突变的致病性预测为后续进一步研究KFS的致病机制提供参考。第二部分先天性颈椎融合畸形的蛋白质组学研究[研究背景]Klippel-Feil 综合征(Klippel-Feil Syndrome,KFS)是一类表现为不少于 2个颈椎椎体和(或)椎体附件融合的罕见疾病。尽管目前已有颈椎椎体融合发病机制的相关文献报道,但由于KFS的罕见性以及临床表现的异质性,其详细的致病机制尚不清晰。在本研究的第一部分中,我们纳入37例KFS患者,并在全外显子水平鉴定了可能与KFS致病相关的新的基因突变位点。然而,生物学功能的直接执行者是蛋白质,基因组和转录组的结果只能部分反映基因表达产物的变化。因此,蛋白质组学的研究才能更有利于体现人体的病理生理状态,探究疾病早期的特定生物标记物,提前采用干预措施以预防疾病潜在的严重后果。我们课题组在前期研究中通过相对和绝对定量的同位素标记(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)比较蛋白质组学技术,探究了 9 名确诊为TBX6相关性先天性脊柱侧凸(Congenital Scoliosis,CS)患者和9名健康对照者的血清蛋白丰度水平差异。研究表明脂质代谢在CS的发病机理中可能起重要作用。尽管CS和KFS均表现为先天性椎体畸形,但尚未有研究解释CS和KFS发病机制之间的潜在差异。因此,我们采用DIA结合Q-精确质谱的蛋白质组学方法,比较KFS患者和健康对照者、KFS患者和CS患者(除外综合征相关性脊柱侧凸和颈椎畸形)的血清蛋白差异,进一步探究KFS的发病机制及其与CS发病机制之间的内在差异,探索脊柱畸形发生于颈部椎体的原因。[目的]本研究旨在描绘KFS的血清蛋白表达谱,筛选差异富集蛋白并鉴定潜在的生物标记物,从而进一步探究KFS的发病机制。[研究方法]我们纳入8名中国汉族人群KFS患者,同时纳入5名不伴有颈部畸形并除外综合征性脊柱侧凸的CS患者作为CS组,以及7名健康志愿者作为对照组。CS组的所有5名患者均表现为先天性胸椎或腰椎融合畸形。通过DIA进行蛋白质组学分析,以同时满足P<0.05且Ratio≥ 1.42或≤ 0.70为原则筛选差异富集蛋白(Differentially Abundant Proteins,DAPs)。其中以 Ratio≥ 1.42 为显著上调,以Ratio≤ 0.70为显著下调。应用Blast2GO软件对差异蛋白进行Gene Ontology(GO)功能注释分析,并使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)数据库进行通路富集分析。[结果]我们对8名KFS患者和7名健康志愿者进行蛋白质组学分析。与对照组相比,在KFS患者中总共鉴定出493种蛋白质,其中49种为差异富集蛋白。在DAPs中,有27种蛋白在KFS组中显著下调,而有22种DAPs在KFS组中显著上调。此外,与CS组相比共鉴定出462种蛋白质,共有192种差异富集蛋白。其中,在KFS组中74种表达显著上调而另外118种显著下调。我们在两组比较中,总共筛选出15种公共的DAPs作为KFS的候选生物标记物,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、CD109抗原、钙粘蛋白-5、过氧化物还原酶-1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、膜伯胺氧化酶、嗅球蛋白和8种免疫球蛋白。通过公共DAPs的丰度水平聚类分析表明,KFS组及CS组中血清免疫球蛋白含量均较正常人群显著下调,而在CS患者中下调更显著。因此,我们推测免疫球蛋白含量及免疫系统功能异常可能与椎体分节和发育有关。KFS患者血清中膜伯胺氧化酶表达显著上调,较正常对照组上调1.6倍;我们提出膜伯胺氧化酶可能是KFS发病机制中与氨基酸代谢相关的候选生物标记物。通过IPA生物通路分析软件计算差异富集蛋白参与的经典通路,我们在两组对比中均筛选出LXR/RXR激活和FXR/RXR激活信号通路,是与脂代谢密切相关的经典通路。此外,研究共发现7种在该信号通路中扮演重要角色的差异富集表达的载脂蛋白(载脂蛋白C-Ⅲ、载脂蛋白A-Ⅳ、载脂蛋白F、载脂蛋白A-Ⅱ、载脂蛋白E、载脂蛋白H和载脂蛋白D)。因此我们推断脂代谢相关信号通路LXR/RXR和FXR/RXR及相关载脂蛋白可能为KFS疾病发生的潜在机制。[结论]本研究首次通过DIA联合Q-精确质谱的蛋白质组学分析,描绘了 KFS的血清蛋白谱。我们在两组比较中筛选出15种公共的差异富集蛋白,作为KFS的候选生物标记物。LXR/RXR和FXR/RXR激活信号通路以及7种差异富集的载脂蛋白可能通过脂代谢途径,从而影响轴旁中胚层、体节和中轴的发育,进而在先天性颈椎融合畸形的致病机制中发挥重要作用。我们推测KFS组与CS组中筛选出的四种差异富集的载脂蛋白(载脂蛋白A-Ⅱ、载脂蛋白E、载脂蛋白H和载脂蛋白D)可能与先天性脊柱畸形发生于颈椎节段相关。