骨折不愈合的诊治研究一直是骨科学长盛不衰的研究课题,然而,其诊断和随访当前仍主要由传统的x线来完成,这种方法仅仅依赖于临床医师的经验和骨折愈合中骨痂的矿化程度,易受投照、冲洗条件及主观因素影响,精确度欠佳,如果骨盐含量变化低于25%,x线就失去了分辨的价值。通常,骨折愈合取决于骨折各个骨折碎块之间肉芽组织的作用,由满意的骨痂合成和新骨痂的再生成互相补充。这些错综复杂的机理就是在成骨细胞、破骨细胞、粒细胞等之间进行相互作用、高度同步。一般的X线成像无法把这一过程清晰地表现出来,这是由于骨折不愈合的X线成像标志与生物化学、组织学的资料不一致。所以,探索监测骨愈合过程新的可行性方法势在必行。关于B超、振动响应、机械阻抗分析及人工神经网络对骨的整体机能、力学状态和变化已有相关的报道,而骨折愈合前后生物因子联合QCT骨密度测定的资料目前在国内外少见记载。理论上讲,先有骨代谢异常,后有形态学变化,存在骨量变化时,生物标志物出现变化的时间应该比骨密度监测的时间变化更早。临床上将超过9个月还没有愈合,并且最近3个月内X线检查未能表现出骨生长迹象的骨折称为骨不连,但骨不连的诊断标准在分子生物学水平上的具体内容目前尚为缺乏和空虚。为了解决上述问题,解决骨不连的早期预测与诊断,进而在各种促进骨质成长的治疗方法包括药物等的疗效评定等方面提供理论和依据,本实验研究借助于骨折不愈合时骨代谢失衡原理,骨吸收-形成偶联学说、胶原代谢、生长因子、血管因子介导及成骨细胞的作用,选择能代表骨代谢的特别标志物,检查它们在骨愈合进程中不同时间的分子水平,和形态学诊断标准(X线)和QCT骨密度测定进行对比,统计学分析和深刻讨论三者的相关性,进一步挖掘出一些特别的生物因子是否骨不连的标志物。作者参考相关文献,建立骨折不愈合的实验动物(兔)模型,术前、术后X线、QCT骨密度测定和生物标志物定期监测,探讨生物标志物和QCT骨密度测定在早期诊断骨不愈合的临床价值,发现实验性骨折不愈合的早期生物标志物变化规律。通过对生物化学骨标志物的综合分析及研究,揭示其在骨新陈代谢中的作用,以此作为工具帮助临床医生检测骨折愈合,为骨折愈合的监测提供一个新的有希望的应用领域。第一章动物模型的建立目的为发现实验性骨折不愈合的生化指标、骨密度变化规律,建立骨折不愈合的动物模型。骨不连的发病机理目前尚不是非常明朗,诸多因素会导致骨不连,包括骨折端的骨缺损、不稳定、软组织嵌插、血循环障碍、感染等。这些因素均可用来制作骨不连动物模型。骨不连动物模型是在实验室条件下,对模型动物的骨折愈合过程进行各种因素干预,最后导致骨不连的发生。完美的骨不连模型必须具有良好的可重复性,除骨折外,还应有骨折周围软组织损伤等,应尽量模仿实际的临床环境。骨不连动物模型可用于探讨骨不连的发生原因,对各种骨不连的新药物、新技术进行评估,拥有广泛的临床前景和社会应用效益。方法选取5-8月龄纯种新西兰大白兔20只,雌雄各半,体质量2.5-3.0kg,随机均分为两组,骨缺损组：在前臂桡骨中段,截除1.5厘米(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔,骨折组只是在前臂桡骨中段造成骨折,两组分别于术前、术后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周进行X线检查。结果骨缺损组和骨折组20只兔均造模成功,全部进入结果分析。骨缺损组X线随访发现从第二周三例有少许骨痂形成,但五周后骨痂情况稳定,术后八周仍无一例愈合。骨折组术后两周开始骨折线模糊,术后六至八周骨痂大量生长。本实验通过术后X射线检测证实15 mm长度骨缺损组骨缺损端均为纤维组织连接,骨断端髓腔封闭。实验兔骨折愈合时间一般为6周,12周未愈合视为骨不连,本实验观察时间达术后12周,15mm长度骨缺损组均未愈合,确定骨不连模型制作成功。模型比较稳定,易于操作和重复。结论本实验观察时间达术后12周,15mm长度骨缺损组均未愈合,均为纤维组织连接,骨断端髓腔封闭,确定骨不连模型制作成功,而且该模型稳定性良好。第二章NTX、CTX、OC及BSAP在早期诊断兔实验性骨不连的作用目的建立骨折不愈合的动物模型,发现实验性骨折不愈合的生化指标变化规律。骨折后骨的重建过程包括三个阶段：骨形成、骨吸收和静止；破骨细胞不断清除旧骨,成骨细胞生成类骨质并进行矿化,这两个骨转换的过程发生在同一重建单位中,并且时间和空间上紧密耦联着。成骨细胞调控着整个骨吸收-骨重建过程。同一骨重建单位中骨生成与骨吸收的平衡决定了骨量的多少。当骨吸收大于骨形成时,平衡被破坏,结果是骨折不愈合的发生。生化标志物可以显示成骨细胞与破骨细胞的活性,从而反应骨转换过程。方法选取5-8月龄纯种新西兰大白兔20只,雌雄各半,体质量2.5-3.0 kg,随机均分为两组,骨缺损组：在前臂桡骨中段,截除1.5厘米(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔,骨折组只是在前臂桡骨中段造成骨折,两组分别于术前、术后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周进行X线检查及抽取血样。检测指标：骨形成特异标志物包括骨钙素(OC),骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)。骨吸收特异标志物包括Ⅰ型胶原羧基端末肽(CTX), Ⅰ型胶原氨基端末肽(NTX),人抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP 5b),方法：生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。结果骨缺损组X线随访发现从第二周三例有少许骨痂形成,但五周后骨痂情况稳定,术后八周仍无一例愈合。骨折组术后两周开始骨折线模糊,术后六至八周骨痂大量生长。骨缺损组BSAP和TRACP 5b术后升高,第四周达到峰值,第五周时出现下降,第六周以后数值基本稳定。骨缺损组BSAP在术后第五周均值最低,与骨折组比较有统计学意义。骨缺损组TRACP5b在术后均值与骨折组比较无统计学意义。骨缺损组OC在术后第四周始均值下降,与骨折组比较有统计学意义。CTX术后4周内波动,第五周时出现一个高峰值,然后下降,第六周以后数值基本稳定。骨缺损组CTX在术后第五周均值最高,与骨折组比较有统计学意义。NTX也在术后4周内波动,第五周开始出现明显下降,术后5周与术前术后各个时间均有统计学意义,术后7周、8周、10周、12周均与术后3周、4周、5周有统计学意义,术后6周以后NTX水平基本稳定。骨缺损组NTX术后第6-12周均值与骨折组比较有统计学意义。结论分析两组手术前后骨代谢指标的变化发现,骨缺损组骨转换维持在较高水平,多个血清生化指标的检测有益于骨折愈合的早期诊断的临床评估。除TRACP5b意义不大之外,骨缺损组中CTX在术后第五周均值最高,OC、BSAP、NTX在术后四或五周均值明显下降,是否可以说明CTX、OC、BSAP、NTX能敏感地反映体内骨转换的状态,各个指标能快速随骨吸收和形成的迅速变化。在排除其他干扰因素情况下,系统性监测生化指标如CTX、OC、BSAP、NTX的变化能反映兔骨折不愈合早期进程,它们是否均可以作为反映骨吸收的敏感性、特异性较强的指标,是否可以早期有效地反映骨转换情况、早期诊断兔的骨不连,有待于我们进一步研究。第三章QCT骨密度测定在兔实验性骨不连的应用目的建立骨折不愈合的动物模型,发现实验性骨折不愈合骨密度变化规律。定量CT测量法(QUANTITATIVE COMPUTER TOMOGRAPHY,QCT,无专用体模法)是利用CT的较高密度分辨率测量骨密度,以骨旁肌肉和脂肪组织做为内参考标准,不需要外部体模,减少了外部体模的各种可能带来的测量误差,比如人工制造体模的不均匀、被测物体与体模对位置变化导致测量结果的偏差等。QCT测量的骨密度值与灰重存在着良好的直线相关性,增进了测量的敏感性、准确性,可重复性强。QCT是判断骨矿含量较好的方法,是目前唯一可以分别测量松质骨和皮质骨密度的技术,这为骨不连的早期诊断、致骨不连不同病因的分析和监测疗效提供了新方法。另外,QCT还可以分析出骨的细微结构,包括：肾小梁长度、连接密度、结构模型参数、骨容积率、骨表面积率、骨小梁厚度、间隔等。方法选取5-8月龄纯种新西兰大白兔20只,雌雄各半,体质量2.5-3.0 kg,随机均分为两组,骨缺损组：在前臂桡骨中段,截除1.5厘米(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔,骨折组只是在前臂桡骨中段造成骨折,两组分别于术前、术后2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、12周进行X线检查、QCT骨密度测定。结果骨缺损组X线随访发现从第二周三例有少许骨痂形成,但五周后骨痂情况稳定,术后八周仍无一例愈合。骨折组术后两周开始骨折线模糊,术后六至八周骨痂大量生长。骨缺损组骨密度值在术后5周开始出现明显下降,与同时间骨折组术前对照值比较差异均有显著性意义,术后6周以后测得的骨密度值总体差异不大,术后2周与术后3周、术后3周与术后4周骨密度值比较差异无显著性意义,术后5周、术后6周分别与术后7周、术后8周、术后10周、术后12周骨密度值比较差异无显著性意义。结论系统性监测骨密度的变化能反映兔骨折不愈合早期进程。QCT骨密度测定在本实验研究中统计学上有显著性意义,是否可以用于早期诊断实验性骨不连,有待于进一步研究。第四章兔实验性骨不连的病理(NTX免疫组化)检测目的建立骨折不愈合的动物模型,发现实验性骨折不愈合的生化指标在组织学、分子水平表达的变化规律。骨的发生一经启动,则由BMP、PDGH、FGF、NTX以及一些非特异性细胞因子、激素等多种因素共同调节,来维持骨细胞代谢过程。NTX是一个溶骨性骨代谢生化指标,是由破骨细胞活性增加导致骨胶原降解产生的,产生后释放致血循环并经尿排泄。它能反映破骨细胞的活性,是敏感而特异的骨吸收指标。骨不连组织上的变化,证实骨不连动物模型的可靠性、可重复性。方法另选取5-8月龄纯种新西兰大白兔20只,雌雄各半,体质量2.5-3.0 kg,随机均分为两组,骨缺损组：在前臂桡骨中段,截除1.5厘米(包括骨膜),骨断端用骨蜡封闭髓腔,骨折组只是在前臂桡骨中段造成骨折,两组分别于术前、术后2,3,4,5,6,7,8,10,12周进行X线检查并各处死一只大白兔进行局部病理取材,分别取术侧骨缺损处、骨折处标本,远近端均保留周围正常骨组织5 mm,共20侧,置于脱钙液中脱钙后利用甲醛固定,行组织切片及苏木精-伊红染色。NTX免疫组化(上海雅吉生物科技有限公司)检测。观察骨缺损、骨折处的骨的再生愈合情况。结果骨缺损组X线随访发现,术后当日：可见所造骨缺损长度确切。从第二周三例有少许骨痂形成,但五周后骨痂情况稳定,术后八周仍无一例愈合。术后12周骨缺损组可见骨缺损处无新生骨痂,中央骨缺损长度较大,基本上均处于骨不愈合状态。骨折组术后两周开始骨折线模糊,术后六至八周骨痂大量生长。组织学改变：术后4周、6周、8周分别处死兔子取材观察,骨缺损区早期为血肿形成,以后逐渐机化形成纤维组织瘢痕,骨端硬化,局部骨折端有反常活动,髓腔闭塞,两侧断端偶尔形成少量骨痂,但一直未见明显骨性连接；光镜下早期见少量新生毛细血管形成,零星骨岛和软骨,以后逐渐被纤维瘢痕组织取代,未见大量骨或软骨形成。术后12周骨缺损组可及缺损两端处有少量未成熟的新生编织骨或类骨组织,将两端髓腔封闭,缺损中央长度较大。骨折组术后5周形成新的骨小梁和骨样组织,术后8周大量骨痂生成。免疫组化观察骨缺损术后4周内,纤维组织、机化的肉芽组织、纤维性骨痂多核细胞胞浆存在NTX弱阳性。第5周开始一直到术后12周,骨缺损肉芽组织内未出现NTX。骨折组术后3周、4周及6周以后骨组织基质内多核细胞胞浆可见NTX阳性。新形成的骨样组织和骨小梁除与软骨组织和纤维组织移行部位的骨样组织含少量NTX外,大部分骨小梁(包括骨基质及骨细胞)均不含NTX；骨母细胞(骨小梁周围)胞浆也呈NTX阳性。结论系统性监测骨不连动物模型骨质组织切片病理改变,本实验观察时间达术后12周,15mm长度实验组均未愈合,确定骨不连模型制作成功,而且该模型稳定性良好。NTX组织免疫组化结果显示,在本实验性骨不连模型中,能动态反应骨不连的部分病理生理改变。结合前方骨代谢指标和QCT BMD测定,证实了NTX可以在兔实验性骨不连的早期预测方面有一定的作用。