在肿瘤微环境领域,能在同一张组织样本上获得不同的细胞表型,并得到其空间位置信息是当前亟待解决的难题。不同荧光探针间的光谱混叠使得难以同时标记检测不同表型的细胞,而样本的重复洗脱标记会使得样本受损,无法准确检测。高光谱显微成像技术有效的结合了显微成像技术和光谱检测技术,显微成像技术用于获取样本形态信息,光谱检测技术主要获取组织样本单点的一定范围的光谱信息,二者的结合能够同时获取生物样本的形态信息和光谱信息。形态信息可以有效获取细胞的空间分布,而光谱信息能够有效解决光谱混叠以及自发荧光干扰,实现组织样本上不同细胞表型获取。本文将棱镜-光栅分光技术、显微成像技术、自动对焦技术和多重荧光标记技术相结合,搭建了全自动推扫式高光谱显微成像系统,以实现肿瘤微环境的研究。系统以尼康研究级倒置荧光显微镜为主体进行设计,采用棱镜-光栅元件进行分光,利用高精度二维电动运动平台进行推扫,同时结合电动调焦组件完成对焦,成像在高灵敏SCMOS相机上。硬件系统搭建后,基于Labview开发软件编写了高光谱显微成像控制软件,包括二维运动平台高精度运动的控制,电动调焦系统进行自动调焦控制,相机成像控制。调整相机的位置,校准平台的运动速度,使相机、分光系统以及二维运动平台共同工作,获取目标样本的推扫图像,对图像原始数据进行采集并存储,对图像进行清晰度评价,选择适合系统的清晰度评价函数对空间分辨率进行测试,对光谱进行标定,完成系统的性能测试。系统光谱范围为420-800nm,光谱采样率2.06nm,光谱分辨率均值优于3.5nm,空间分辨率优于0.87μm。同时,针对推扫式高光谱显微成像系统中难以自动对焦的问题,采用被动对焦和主动对焦的方式进行实验。从成像清晰度、成像速度和系统复杂度三个方面,比较分析两种对焦方法的优劣,解决了高光谱显微成像系统中无法实现对焦的难题,实现了生物样本在40倍物镜下3.25mm×3.25mm大视场成像。最后,以单色激光激发的4色量子点标记病理切片为研究对象,进行多重荧光标记成像,并对混合信号进行光谱解混。结果表明高光谱显微成像系统可以消除荧光光谱重叠的干扰,同时可以有效的检测多重荧光标记,有望实现在同一张组织样本上同时获取不同细胞表型和空间位置信息,为肿瘤微环境领域的研究提供帮助。