【摘 要】
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氢气作为化工行业重要的生产原料,也是最清洁的可再生能源之一。微生物暗发酵制氢反应条件温和、对环境友好、无污染,是极具应用前景的制氢工艺之一。微生物产氢效率较低是限制该技术产业化应用的瓶颈问题。因此,挖掘微生物的产氢潜能,打破微生物制氢效率瓶颈,是生物制氢走向产业化应用的关键。产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）培养条件简单、生长速度快、可高密度培养、底物利用范围广,且可以与有
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氢气作为化工行业重要的生产原料,也是最清洁的可再生能源之一。微生物暗发酵制氢反应条件温和、对环境友好、无污染,是极具应用前景的制氢工艺之一。微生物产氢效率较低是限制该技术产业化应用的瓶颈问题。因此,挖掘微生物的产氢潜能,打破微生物制氢效率瓶颈,是生物制氢走向产业化应用的关键。产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）培养条件简单、生长速度快、可高密度培养、底物利用范围广,且可以与有机废水处理相结合制备氢气,是近年来备受关注的产氢菌。本研究以产气肠杆菌E.aerogenes IAM1183（Wild type）和EaΔCDE（Δnuo CDE）为出发菌株,利用λ-Red同源重组系统介导的基因编辑技术对NADH产氢途径的关键酶——NADH脱氢酶基因簇上的NuoF亚基编码基因进行敲除,分别表达甲酸氢裂解酶激活蛋白编码基因（fhlA）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因（pckA）,多基因组合代谢工程调控胞内NADH供给,探究工程菌产氢性能及底物再分配的变化。总结实验结果如下:1、100 m L血清瓶发酵结果显示基因敲除菌株的氢气产量相比原始菌株都有明显提升,EaΔF（Δnuo F）、EaΔCDEF（Δnuo CDEF）产氢总量分别增加了26.5%、23.8%。进一步分析表明nuo F基因缺失后,突变株胞内NADH/NAD+上升,NADH途径产氢水平也相应地有所提高,而甲酸途径产氢水平则无明显变化。2、表达pckA基因后,由于NADH途径产氢水平的上调,突变株产氢总量也明显上涨。表达fhlA基因后,Ea/F（fhlA）甲酸途径产氢量相较于原始菌株增加了29.7%,而EaΔF/F（Δnuo F/fhlA）及EaΔCDEF/F（Δnuo CDEF/fhlA）则NADH途径产氢水平提高,这可能是因为nuo F基因敲除使得NADH途径产氢的竞争力变大,更多底物流向该途径。3、代谢流分析表明,乙醇是突变株及原始菌株厌氧发酵后的主要副产物,减少乙醇合成途径对产氢代谢中NADH辅因子的消耗或将有利于进一步促进菌株产氢。4、选择小规模发酵中产氢表现最好的菌株EaΔCDEF/P（Δnuo CDEF/pckA）进一步进行5 L发酵罐发酵,16 h后该菌株产氢逐渐停止,并达到最大值4.5 L,而原始菌株的氢气产量只有3.84 L,该突变株表现出一定的产氢优势。本研究将为利用基因工程手段调控菌株代谢促进产氢提供新的攻关思路,也为生物制氢提供优秀工程菌株。
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