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目的:
心肌肥大是心力衰竭发生发展的关键环节。研究表明，分选蛋白16C SNX16)与心力衰竭密切相关。Ensemble数据库GWAS分析显示，心衰病人的Snx16基因存在单碱基突变;在斑马鱼的心衰模型中，心肌细胞Snx16的mRNA表达显著升高。研究表明，SNX16广泛参与蛋白质运输、物质内吞和细胞信号转导等过程。然而，SNX16在维持正常心脏功能中的作用以及对心脏疾病发生发展的影响尚未见报道。本研究旨在明确SNX16在正常及病理性心肌肥大的心肌细胞中的作用，并深入探讨其分子机制，从而为心肌肥大的早期预防和干预提供新的靶点和实验依据。
方法:
1.心脏特异性敲除Snx16小鼠的构建:本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在小鼠Snx16基因exon2的两侧插入loxP序列，获得SNX16f/+杂合子小鼠。再与Mlc-2v cre小鼠杂交，获得心脏特异性敲除Snx16基因的小鼠(SNX16f/f+Cre)。
2.小鼠心肌肥大模型的建立:选择8-12周的WT、SNX16f/f+Cre和SNX16f/f+Cre小鼠，经皮下微渗泵持续注射AngⅡ(2μg/min/kg)14天，诱导小鼠心肌肥大。检测实验小鼠的心脏形态、心脏体重比、超声心动和血压等。
3.体外心肌细胞肥大模型的建立和药物剌激:构建SNX16过表达载体，并将其转染新生大鼠心肌细胞(NRVM)、新生小鼠心肌细胞(NMVM)和大鼠心肌细胞系(H9C2)。加入200nM AngⅡ刺激48h诱导心肌细胞肥大，观察SNX16过表达对心肌肥大的影响。
4.基因mRNA和蛋白表达水平检测以及免疫组化分析:1)通过鬼笔环肤或α-actinin对心肌细胞骨架蛋白染色，统计单个细胞(注50个)面积，分析SNX16敲除或过表达后对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响。2)利用Westem bolt和RT-qPCR技术检测SNX16表达水平增加或减少时，心肌细胞中肥大标志物ANP、BNP的变化，以及心肌肥大时EGFR/ERK1/2信号通路中关键蛋白表达水平的变化。
结果:
1.SNX16在2月龄C57BL/6小鼠的心、肝、脑、脾、肺、肾、肌肉、脂肪等组织的表达水平不一致。SNX16在小鼠心、肺和肾等组织中的表达量相对较低，而在肝、脑、脾、肌肉和脂肪等组织中的表达量较高。
2.AngⅡ刺激所致小鼠心肌肥大模型的心肌组织Snx16mRNA和蛋白表达水平明显增加。过表达SNX16心肌细胞呈现心肌肥大的表型，如细胞面积增大、心肌肥大标志物CANP、BNP)表达增加。
3.心脏特异性敲除Snx16基因对小鼠体重、心功能、心脏体积及组织结构等都无明显影响。心脏Snx16缺失明显抑制AngⅡ诱导的病理性心肌肥大，表现为显著缓解AngⅡ诱导引起的心脏体积增大、心脏体重比增加、心肌细胞面积增加、心肌肥大标志物表达增加、心功能增强和血压升高。
4.AngⅡ诱导的心肌肥大组织的E GFR/ERK1/2信号通路活性明显提高。心脏特异性敲除Snx16基因可明显抑制心肌细胞EGFR及其下游关键分子ERK1/2的磷酸化，而过表达SNX16基因则显著增加EGFR和ERK1/2的磷酸化。
5.AZD9291是EGFR的不可逆抑制剂，可有效抑制EGF介导的EGFR磷酸化，进而阻止下游分子ERK的活化。ADZ9291处理心肌细胞能明显抑制SNX16过表达导致的EGF即ERK1/2信号通路激活，从而减轻心肌肥大。表明SNX16对心肌肥大的促进作用是依赖于EGFR信号通路的激活。
结论:
1.体内和体外实验均证明，在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中，Snx16m时怡和蛋白表达显著增加。
2.心肌细胞过表达SNX16可引起心肌细胞面积增大，心肌肥大标志物ANP、BNP表达增加，其机制可能与SNX16过表达激活EGFR/ERK1/2信号通路有关。
3.心脏特异性敲除Snx16基因对小鼠心脏的结构和功能无明显影响。心脏Snx16缺失能显著减轻AngⅡ刺激导致的小鼠心肌肥大，其机制与其明显抑制AngⅡ刺激导致的EGFR/ERK1/2信号通路激活有关。
心肌肥大是心力衰竭发生发展的关键环节。研究表明，分选蛋白16C SNX16)与心力衰竭密切相关。Ensemble数据库GWAS分析显示，心衰病人的Snx16基因存在单碱基突变;在斑马鱼的心衰模型中，心肌细胞Snx16的mRNA表达显著升高。研究表明，SNX16广泛参与蛋白质运输、物质内吞和细胞信号转导等过程。然而，SNX16在维持正常心脏功能中的作用以及对心脏疾病发生发展的影响尚未见报道。本研究旨在明确SNX16在正常及病理性心肌肥大的心肌细胞中的作用，并深入探讨其分子机制，从而为心肌肥大的早期预防和干预提供新的靶点和实验依据。
方法:
1.心脏特异性敲除Snx16小鼠的构建:本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在小鼠Snx16基因exon2的两侧插入loxP序列，获得SNX16f/+杂合子小鼠。再与Mlc-2v cre小鼠杂交，获得心脏特异性敲除Snx16基因的小鼠(SNX16f/f+Cre)。
2.小鼠心肌肥大模型的建立:选择8-12周的WT、SNX16f/f+Cre和SNX16f/f+Cre小鼠，经皮下微渗泵持续注射AngⅡ(2μg/min/kg)14天，诱导小鼠心肌肥大。检测实验小鼠的心脏形态、心脏体重比、超声心动和血压等。
3.体外心肌细胞肥大模型的建立和药物剌激:构建SNX16过表达载体，并将其转染新生大鼠心肌细胞(NRVM)、新生小鼠心肌细胞(NMVM)和大鼠心肌细胞系(H9C2)。加入200nM AngⅡ刺激48h诱导心肌细胞肥大，观察SNX16过表达对心肌肥大的影响。
4.基因mRNA和蛋白表达水平检测以及免疫组化分析:1)通过鬼笔环肤或α-actinin对心肌细胞骨架蛋白染色，统计单个细胞(注50个)面积，分析SNX16敲除或过表达后对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响。2)利用Westem bolt和RT-qPCR技术检测SNX16表达水平增加或减少时，心肌细胞中肥大标志物ANP、BNP的变化，以及心肌肥大时EGFR/ERK1/2信号通路中关键蛋白表达水平的变化。
结果:
1.SNX16在2月龄C57BL/6小鼠的心、肝、脑、脾、肺、肾、肌肉、脂肪等组织的表达水平不一致。SNX16在小鼠心、肺和肾等组织中的表达量相对较低，而在肝、脑、脾、肌肉和脂肪等组织中的表达量较高。
2.AngⅡ刺激所致小鼠心肌肥大模型的心肌组织Snx16mRNA和蛋白表达水平明显增加。过表达SNX16心肌细胞呈现心肌肥大的表型，如细胞面积增大、心肌肥大标志物CANP、BNP)表达增加。
3.心脏特异性敲除Snx16基因对小鼠体重、心功能、心脏体积及组织结构等都无明显影响。心脏Snx16缺失明显抑制AngⅡ诱导的病理性心肌肥大，表现为显著缓解AngⅡ诱导引起的心脏体积增大、心脏体重比增加、心肌细胞面积增加、心肌肥大标志物表达增加、心功能增强和血压升高。
4.AngⅡ诱导的心肌肥大组织的E GFR/ERK1/2信号通路活性明显提高。心脏特异性敲除Snx16基因可明显抑制心肌细胞EGFR及其下游关键分子ERK1/2的磷酸化，而过表达SNX16基因则显著增加EGFR和ERK1/2的磷酸化。
5.AZD9291是EGFR的不可逆抑制剂，可有效抑制EGF介导的EGFR磷酸化，进而阻止下游分子ERK的活化。ADZ9291处理心肌细胞能明显抑制SNX16过表达导致的EGF即ERK1/2信号通路激活，从而减轻心肌肥大。表明SNX16对心肌肥大的促进作用是依赖于EGFR信号通路的激活。
结论:
1.体内和体外实验均证明，在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中，Snx16m时怡和蛋白表达显著增加。
2.心肌细胞过表达SNX16可引起心肌细胞面积增大，心肌肥大标志物ANP、BNP表达增加，其机制可能与SNX16过表达激活EGFR/ERK1/2信号通路有关。
3.心脏特异性敲除Snx16基因对小鼠心脏的结构和功能无明显影响。心脏Snx16缺失能显著减轻AngⅡ刺激导致的小鼠心肌肥大，其机制与其明显抑制AngⅡ刺激导致的EGFR/ERK1/2信号通路激活有关。