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[背景] 血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）是1997年Tan等率先通过筛选人脐静脉内皮细胞cDNA文库发现的，因属于TNF超家族成员，当时命名为TL1（TNF-like ligand 1）。后因研究发现，VEGI174的胞外区具有抑制内皮细胞增殖的作用，因此大多称之为VEGI。Chew等发现，VEGI全长基因为17Kb，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个外显子和三个内含子构成。按不同的拼接方式拼接产生三种mRNA，分别编码由251、192、174个氨基酸残基组成的VEGI251、VEGI192和VEGI174异构体。三者均含有Ⅳb外显子，其中VEGI251和VEGI174的C末端有151个氨基酸相同。目前，国内外对Ⅳb外显子编码的蛋白质的结构和功能研究较多。Zhai等研究发现，转染由IL-2的28个氨基酸残基组成分泌信号肽和可能的VEGI174的胞外区构成的融合蛋白基因(sVEGI174)转染肿瘤细胞后能有效抑制肿瘤的生长，而将包括跨膜区的全长VEGI174基因表达载体的转染到肿瘤细胞中不能有效抑制肿瘤的生长，说明只有VEGI174的胞外区具有抑制内皮细胞生长的作用。 VEGI251是由全长基因、4个开放读码框架编码的蛋白质，属TNF超家族成员，与TNF家族其他成员的氨基酸同源性最大为24.6％。与其他TNF超家族相同，VEGI251为Ⅱ型跨膜蛋白，胞浆外C末端179个氨基酸残基组成其可溶性分子，组成其活性部分。生物活性的研究发现，VEGI251是DR3和TR6／DcR3的TNF样配体，能诱导T细胞增殖和诱导红白血病细胞的凋亡等；而sVEGI174具有诱导血管内皮细胞凋亡，激活JNK与P38MAPK等生物学活性，而且可以抑制新生血管生成从而抑制肿瘤的生长。尽管他们C末端结构相同，但其生物活性有较大的不同。本课题在我室对sVEGI174的结构与功能及作用机制研究的基础上，克隆、表达了可溶性VEGI72-251，并对其功能进行了研究。 [目的] （1） 从人脐静脉细胞中克隆VEGI251 cDNA的可溶性胞外区编码基因VEGI72-251，长度为540bp；5第二军医大学硕士学位论文 （2）将VEGI72.25，基因在大肠杆菌中进行诱导表达，并对表达产物进行纯化; （3）研究可溶性VEG玩一251的生物学活性及其可能的作用机制: （4）可溶性vEGI72.2sl和s泥01:74的活性比较，分析可能的机制。〔方法〕 （l）本研究用RT一PCR方法，从人脐静脉细胞总RNA中扩增可溶性VEG1251胞外区（即VEGI72一1）的。DNA序列，用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，胶回收目的基因片段，连接到pMD18一克隆载体中，转化大肠杆菌DHSQ，PCR和酶切筛选阳性克隆，全自动DNA测序验证序列[2’]; （2）vEGI72一251亚克隆到nBV220表达载体中，转化大肠杆菌DHSQ，酶切鉴定，阳性克隆用42℃热诱导表达，表达产物用SDS一PAGE分析和westem blot验证; （3）重组蛋白质的纯化; （4）偶氮显色法检测样品的内毒素含量; （5）用体外培养的肿瘤细胞对表达产物进行活性检测122]，酶标仪测OD值; （6）鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成影响的检测123]; （7）用ELISA法检测VEGI作用pBMC24h后培养上清中IL一2和IFN，的含量; （8）建立了C57小鼠种植B16细胞的肿瘤模型，采用此模型研究可溶性VEGI25;对肿瘤生长的影响; （9）可溶性VEGI7225;和sVEGI:7;的活性比较，分析可能的机制。〔结果〕 （1）成功地从人脐静脉内皮细胞中克隆了可溶性VEGI251胞外区VEG玩一251的基因，测序结果与文献一致; （2）可溶性VEGI251胞外区蛋白在大肠杆菌DHSQ中获得高效表达。SDS-PAGE分析表明，蛋白质主要以包涵体形式存在于细菌中，经洗涤、溶解、复性、DEAE阴离子交换柱和SephacryS一200层析柱纯化后蛋白质纯度约为94.5%。测6第二军医大学硕士学位论文定分子量约为20kDa，与预期大小一致。偶氮显色法检测样品的内毒素含量为80EU/mg。Westem blot结果表明，该蛋白能与兔抗人sVEGll7;多克隆抗体特异性结合。细胞活性检测结果表明，可溶性vEGI25;胞外区蛋白在（080p留ml）浓度范围内对HUVEC、ECV3O4、Molt一4、B16等细胞的形态无明显影响，MTT法检测细胞数量无明显改变。ELISA检测结果表明，可溶性VEG玩一51能刺激PBMC细胞的工L一2和IF林分泌增多。C57小鼠种植B16细胞的肿瘤模型的研究表明，可溶性VEGI72一25;不能抑制B16细胞在C57小鼠的生长。〔结论〕 （1） vEGI7225，胞外区在大肠杆菌中以包涵体的形式获得较高的表达，达菌体总蛋白的25.6%; （2）VEGI72一251胞外区蛋白质经纯化后，纯度达到94.5%。经复性后具有明显的生物学活性，可刺激T细胞IL一2和IFN丫分泌增多; （3）VEGI72一25一与sVEGI一科的生物学活性不同:虽然VEGI72一251胞外区C末端的约146个氨基酸与sVEGll7;相同，但VEG玩一251不能抑制内皮细胞的和鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，而sVEGll74则不能激PBMC细胞工L一2分泌增多。蛋白质的氨基酸数量和增加或减少序列变化会改变蛋白质的空间结构，从而影响蛋白质与相应配、受体的结合，改变蛋白质的功能l2’一26]。推测vEGI7225，与T细胞受体结合的结构位于其N端，N端增加的29个氨基酸残基具有与T细胞结合的结构;而N端增加的氨基?