论文部分内容阅读
丰加霉素(Toyocamycin)是核苷类抗生素家族的重要成员,其在农业植物病害防治领域具有巨大的应用价值。为改善丰加霉素产生菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes1628)发酵过程溶氧限制,旨在实现vgb基因在S.diastatochromogenes1628中的AcerOBP11基因以促进丰加霉素的生物合成。 首先,尝试了PEG-介导的原生质体转化,电击转化,接合转移三种遗传转化方法在S.diastatochromogenes1628的应用,并分别对其条件进行了优化。原生质体转化的最优条件为:用CP培养基,培养基中加入1％的甘氨酸培养48h,用3mg/mL的溶菌酶酶解1h制得的原生质体在R2YE培养基上再生和转化的效率最高。在浓度为30%(w/v)的PEG1000介导下,1×109/mL的原生质体与1μg的pIJ702质粒,可获得最高转化效率:4.8×103转化子/μg DNA。电击转化的最优条件为:用预处理的菌丝体作为电击处理的对象,用PGS缓冲液,电击条件为:25μF,200Ω,12kV/cm,转化效率最高为(3±0.4)×104转化子/μg DNA。接合转移的最优条件为:用预萌发的孢子作为受体,与供体菌ET12567(pUZ8002)按108:108的浓度混合涂布,16-20h后,用1mL终浓度均为50μg/mL的安普霉素和萘啶酮酸水溶液覆盖平板,最终得到348个接合子。 其次,基于载体 pIB139,以gfp为报告基因检测红霉素抗性基因启动子PermE*在S. diastatochromogenes1628中的转录活性,重组菌1628-GFP在荧光显微镜下观察显示,菌丝可发出稳定明亮的绿色荧光,表明启动子PermE*在菌株1628中可有效启动外源基因的表达。在此基础上,利用PermE*实现vgb基因的异源表达。重组菌1628-VHB通过CO-差光谱分析显示VHb具有生物学活性;摇瓶实验表明:与原始菌株相比,重组菌可促进丰加霉素产量的提高,在中度和高度限氧条件下促进效果尤为明显,提高幅度分别为48.9%和104.5%。从40株重组菌中筛选到一株丰加霉素的高产菌株,编号为H23,在普通溶氧和中度限氧条件下,其产素水平较原始菌株分别提高29.2%和96.7%。PCR和发酵效价检测显示重组菌具有良好的遗传稳定性。本研究首次成功实现了vgb基因在S.diastatochromogenes1628的表达,有效提高了其丰加霉素的合成水平,为进一步推动丰加霉素的工业化生产提供了基础条件。