胶原作为一种重要的动物蛋白质,在食品、美容、组织工程、生物材料等领域应用十分广泛,由于不同类型的胶原以及不同动物来源的胶原及其降解物在氨基酸组成、等电点、分子量、亲疏水性、免疫原性等方面差异不显著,导致其质量控制非常困难。传统的检测方法(如SDS-PAGE,毛细管电泳法,比色法,高效液相色谱法,免疫学检测法等)用于胶原检测在定量、定性等方面存在一定的局限性。不同类型胶原以及不同动物来源的胶原在氨基酸序列等方面存在显著差异,这些序列差异可作为类型识别或动物溯源的依据,通过适当方法检测差异序列为胶原的质量控制提供了理论依据。本研究以高效液相色谱-质谱为基础,旨在建立一种胶原检测分析方法,采用高效液相色谱-质谱联用技术结合色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点,能够在胶原酶解后的大量肽段中分离出不同类型胶原的特征肽并进行定量。论文取得的主要研究成果如下:(1)通过模型蛋白研究了基于特征多肽进行胶原类型识别和定量检测的可行性。以牛I型胶原为模型,通过序列比对进行了特征多肽比对。利用高效液相色谱-离子阱质谱对胶原降解物进行了定性分析,筛选出牛I型胶原特征多肽GFSGLDGAK。结果表明,特征多肽在质谱数据中信号强,二级质谱多肽片段明确,筛选出的多肽可作为相应动物胶原的特征多肽,可用于筛选其他物种或其他类型胶原的特征肽段。实验进一步研究了方法用于猪I、III型胶原以及大鼠I、III胶原类型识别的可行性,筛选出可用于类型识别的特征多肽,包括猪I型胶原特征多肽GETGPAGPAGPVGPVGAR、猪III型胶原特征肽段GPP*GAVGPSGPR、大鼠I型胶原特征肽段GPAGPSGPIGK、大鼠III型胶原特征肽段GPVGPHGPPGK。(2)样品处理方法筛选与分析条件优化。以牛的I型胶原为实际样品,对前处理条件进行了优化,结果表明,样品与胰蛋白酶比例为50:1时,在37℃下,酶解16h,可达到酶解的最佳效果。在前处理步骤中,样品经过的两次加热处理不会使特征多肽遭到破坏而影响定量的准确性。在质谱分析中,材料选择离子二级质谱分析可提高方法的稳定性和重复性,在优化条件下,信号保持稳定,同一样品连续进样3次,所测峰面积值的相对标准偏差为0.38%-1.45%。(3)建立了基于特定多肽的胶原定量检测方法。实验经过定性分析筛选出特征肽段,前处理条件的优化分析后,化学合成了特征多肽,GFSGLDGAK。对90个牛I型胶原样品进行定量分析,证明了基于特征多肽进行定量分析的可行性。完成了定量分析的方法学研究,利用该方法对胶原产品的稳定性、均匀性和定值进行分析,确定该产品中牛I型胶原含量为0.926±0.014mg/mg,证明了方法的准确性。(4)基于特征多肽的检测方法在胶原降解物质量控制方法中的应用。利用建立的方法对胶原基产品-阿胶及原料-皮料进行检测,证明了该方法对胶原产品及原料等众多胶原基样品检测的可行性。阿胶样品中均检测出驴皮胶原蛋白肽(分子量为1077.6Da),虽然阿胶产品中胶原已降解,但分子量高于1077.6Da的蛋白肽占比越大,样品中特征肽的含量越高。实验检测得到猪皮和鼠皮中胶原含量,结果表明皮肤中胶原含量先随年龄呈上升趋势,成年后胶原流失,含量逐渐下降。实验准确测定不同年龄阶段猪皮和鼠皮中I型和III型胶原含量。3周龄猪皮中I型胶原含量为0.256mg/mg,III型胶原含量为0.104mg/mg,随后I型胶原含量持续升高,III型胶原含量持续降低,在12周龄猪皮中I型胶原含量为0.497mg/mg,III型胶原含量为0.079mg/mg。大鼠在7周龄时,皮肤中胶原含量最高,为0.7738mg/mg,其中I型胶原含量为0.7329mg/mg。不同年龄阶段皮肤胶原含量的测定,为抗衰老等相关研究提供依据,或为以皮肤为原料的胶原生产,选择适龄的皮肤原料提供依据。基于特征多肽的胶原检测方法在含胶原的食品、药物、胶原基医用材料等领域应用前景广阔。