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Rett综合征(Rett syndrome,RTT)是一种X连锁的神经发育障碍性遗传病,在女性严重智力低下的致病因素中占主导地位。编码甲基化CpG结合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)的基因发生突变是导致RTT病理学改变的主要原因,MeCP2作为转录抑制因子调控基因表达。在RTT发病机制中,由于缺乏MeCP2蛋白与甲基化DNA的结合,阻碍了其对下游靶基因的调控,最终导致脑功能障碍。目前,对于MeCP2在脑发育过程中的重要作用以及如何导致RTT的发生发展,其机制尚未明确。而且目前还没有针对RTT的获批准的治疗药物上市,减轻RTT的症状将成为一个重要的治疗手段。因此本实验从RTT致病的根本原因考虑,以增加MeCP2表达水平为研究方向,从分子和基因两方面来探究IMPX977对大鼠MeCP2表达的影响,同时应用免疫共沉淀联用质谱技术研究MeCP2相互作用蛋白分子,试图探索MeCP2蛋白在体内的生物学功能。实验共分为四个部分:第一章正常雄性大鼠各组织中MeCP2的表达目的为了研究RTT的发病机制中MeCP2基因产物的功能和定位,我们进行了MeCP2蛋白大鼠体内区域分布的研究,对多种组织的裂解液进行免疫印迹分析和实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定,以期从分子和基因水平层面研究MeCP2在野生型雄性大鼠体内的组织分布。方法将6周龄野生型雄性大鼠置于动物房饲养三天,取出用水合氯醛麻醉后断头处死,在冰浴上迅速分离海马、皮层、小脑组织,并分离心、肝、脾、肺、肾和肌肉组织,通过Western blotting技术,研究MeCP2蛋白在大鼠体内的组织分布;同时,提取多种组织的总RNA,检测完整性,逆转录成cDNA后,进行RT-PCR检测,在分子层面研究MeCP2mRNA的表达水平。结果Western blotting实验结果显示MeCP2蛋白主要在脑组织中高表达,包括小脑、皮层和海马组织,其次为脾、肺和心脏组织,在肝脏、肾脏和肌肉中含量较少。RT-PCR实验结果显示海马、皮层和小脑组织中MeCP2 mRNA高表达。结论MeCP2蛋白在大鼠的神经发育中起着重要的作用,MeCP2蛋白和mRNA水平没有明显的关联,可能原因是存在转录后调控的组织特异性。第二章IMPX977对雄性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响目的研究不同剂量的IMPX977对雄性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响。方法将雄性SD大鼠分为4组,空白对照组、橄榄油组(阴性对照组)、IMPX977低剂量组(10mg/kg)和IMPX977高剂量组(30mg/kg)。连续灌胃给药两周,末次给药结束后水合氯醛麻醉断头取脑,分离皮层、小脑、心、脾和肺组织。通过Western blotting技术,研究不同剂量IMPX977对多种组织中MeCP2蛋白表达的影响。同时,提取小脑和皮层组织中的总RNA,检测完整性,逆转录成cDNA后,进行RT-PCR检测,在分子层面研究IMPX977对MeCP2 mRNA表达水平的影响。结果Western blotting实验结果显示,与空白对照组相比,橄榄油组大鼠小脑和心脏组织中MeCP2蛋白表达水平均明显升高(<0.05,P<0.05),而IMPX977高剂量组大鼠心脏和脾脏组织中MeCP2蛋白的表达量都显著性降低(P<0.01,P<0.05)。同时,IMPX977低剂量组皮层组织中MeCP2蛋白表达显著上调。RT-PCR实验结果显示,相较于空白对照组或者阴性对照组,IMPX977低剂量组大鼠小脑组织中MeCP2蛋白的表达量明显升高。而与空白对照组相比,IMPX977低剂量组和高剂量组大鼠皮层组织中MeCP2基因的表达量均显著性降低。结论低剂量IMPX977(10 mg/kg)对雄性大鼠皮层组织中MeCP2蛋白的表达有显著上调的作用,但是与基因表达水平趋势并不一致。第三章IMPX977对雌性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响目的研究不同剂量的IMPX977对雌性大鼠各组织中MeCP2表达量的影响。方法将雌性SD大鼠分为4组,空白对照组、橄榄油组(阴性对照组)、IMPX977低剂量组(10 mg/kg)和IMPX977高剂量组(30 mg/kg)。连续灌胃给药两周,末次给药结束后断头处死,冰浴上迅速分离皮层和小脑组织。通过Western blotting技术,研究不同剂量IMPX977对两种组织中MeCP2蛋白表达量的影响。同时,提取小脑和皮层组织中的总RNA,逆转录成cDNA后,进行RT-PCR分析,在分子层面研究不同剂量IMPX977对MeCP2 mRNA表达水平的影响。结果Western blotting实验结果显示,与空白对照组相比,橄榄油组、IMPX977低剂量组和高剂量组大鼠小脑组织中MeCP2蛋白表达水平均有升高,但都没有显著性差异(P>0.05,P>0.05)。RT-PCR实验结果显示,相较于空白对照组,其他三组大鼠小脑组织中MeCP2基因表达水平没有明显变化。而阴性对照组和IMPX977高剂量组大鼠皮层组织中MeCP2基因表达量均显著降低。结论两种剂量的IMPX977对雌性大鼠小脑、皮层组织中MeCP2蛋白的表达没有明显变化。第四章免疫共沉淀联合质谱筛选MeCP2相互作用蛋白质及蛋白质相互作用数据评价目的研究皮层组织中MeCP2相互作用蛋白质,试图探索MeCP2在皮层组织中如何发挥生理功能。方法将雄性SD大鼠、C57BL/6小鼠和雌性食蟹猴饲养一周后,用水合氯醛(0.3-0.4 mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠和小鼠,用盐酸氯胺酮(3 mg/kg)肌肉注射麻醉食蟹猴,在冰浴上迅速分离皮层组织。通过IP-MS(免疫共沉淀联用质谱)技术、Western blotting技术、SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色、切取SDS-PAGE胶上蛋白质LTQ质谱鉴定其组成成分,探究在不同生物皮层组织中MeCP2相互作用的蛋白质,采用生物信息学方法对所获得的候选蛋白质进行评估分析。结果考马斯亮蓝染色结果显示,MeCP2蛋白呈现清晰的条带,且在大鼠、小鼠、食蟹猴样品中的颜色深浅不一,MeCP2蛋白总量高低不同。Western blotting结果显示,在小鼠input样品中,MeCP2蛋白得到了富集,且在大鼠、小鼠和食蟹猴IP样品中MeCP2的含量不一,相对分子质量也不相同。应用生物信息学对小鼠IP-MS结果进行分析,发现MeCP2相互作用蛋白候选分子肽段数最高的是KIF5B和KCL1,靶蛋白主要与信号转导通路、细胞应激反应、转录调控等过程有关,其中与EGFR信号转导通路、FGF信号转导通路、Wnt信号转导通路、Cadherin信号转导通路关系密切,并参与了帕金森病、亨廷顿舞蹈症等疾病的发病过程。结论这些相互作用蛋白质的获得为全面揭示MeCP2的生物学功能、深入研究MeCP2转录调控机制以及其参与RTT发病过程均提供了线索和研究思路,为我们下一步的深入研究提供了科学依据。