近二十年来,在“脾主运化”及“脾健不在补贵在运”等中医理论指导下,国内学者广泛使用运脾法治疗小儿厌食取得很好疗效,并系统研究了运脾法对消化吸收功能的影响,在外周水平上证实运脾法对胃肠道的运动和分泌有显著的调节作用。近几年,我们采用病因模拟法成功建立了幼龄大鼠厌食模型并发现该模型下丘脑和外周CCK-8S水平显著增高,食欲中枢——下丘脑外侧区(LHA)神经元自发放电频率减低和下丘脑腹内侧区(VMH)神经元自发放电频率增加,临床治疗小儿厌食有可靠疗效的运脾复方不仅可调节外周血中与摄食有关的肽类激素水平,如降低CCK-8S水平,而且能调节下丘脑食欲中枢神经元的自发放电频率。该结果提示运脾法不仅能在外周水平上影响胃肠道功能,而且能在大脑水平上干预摄食控制过程,达到促进食欲的目的。关于摄食控制的基础研究表明,一方面食物进入胃肠道后,激活肠道的内分泌细胞,分泌多种脑肠肽如CCK-8S,这些脑肠肽在血中的水平作为外周信号可通过“肠—脑轴”传入中枢神经系统介导消化和摄食行为的部位,影响摄食中枢神经元的活动调节动物的摄食行为;另一方面中枢神经元可合成释放内源性的神经肽直接作用于摄食中枢神经元调节摄食,如中枢鳃旁体神经元的神经纤维就可延伸到达VMH,并且合成释放内源性的CCK-8S。CCK-8S是一种激素和神经递质,广泛存在于外周和中枢神经系统,在调控摄食的生理过程中起着关键作用。VMH是下丘脑基底部最大的核团,大量研究表明VMH是调控摄食的饱中枢,而这个生理过程又受到许多内源性因素和递质——如CCK-8S,5-羟色胺,葡萄糖等的调控。但CCK-8S是如何对VMH神经元起作用以及它的受体机制(CCK-A或CCK-B)尚不清楚。有研究表明,下丘脑VMH神经元的自发放电频率和膜电位振荡的反应可能是由激活阈值低于电压门控Na通道的电流决定的。这说明阈下电流如超极化激活电流(Ih)和A型钾电流(IA)可能影响了他们的电活动。更重要的是这种电流可以直接调控神经元的放电频率,并且神经递质可以调控这种电流,因此我们推测这种阈下电流是否也是影响VMH神经元电活动的主要因素,并且CCK-8S是否也是通过调节这种电流而影响VMH神经元的电活动的。基于上述背景,我们推测运脾法可能是通过影响“肠-脑轴”的活动促进食欲的,即:运脾复方改变下丘脑和外周CCK-8S水平改变食欲中枢神经元离子通道改变神经元放电频率最终影响摄食行为在我们过去的研究中,已经证实了运脾复方既能改变外周和中枢CCK-8S水平,又能调节中枢神经元放电频率进而最终影响实验动物摄食行为。本实验以幼龄大鼠下丘脑VMH神经元为研究对象,采用红外可视脑片膜片钳技术,在电流钳下,记录VMH不同类型神经元的膜电特性及CCK-8S对不同类型神经元自发放电频率的影响;在电压钳下,检测外加CCK-8S前后VMH神经元的电流变化及对自发放电的影响。本实验重点在于研究运脾复方通过对下丘脑和外周CCK-8S水平的影响进而调节下丘脑神经元放电频率的中间环节——即:CCK-8S对食欲中枢VMH神经元兴奋性调节的离子通道机制,以进一步明确运脾法调节“肠-脑轴”促进摄食的中枢机制。主要研究结果:1.大鼠下丘脑VMH神经元的电生理特征和三种细胞类型1) I型神经元:I型神经元在静息电位没有自发放电,并有相对较小的膜时间常数和输入电阻,分别为(8±1)msec(n=4)和(192±39) MΩ(n=4);在检测中3/31个细胞属于此类。2)Ⅱ型神经元:Ⅱ型神经元静息电位具有自发放电,膜时间常数(14±1) msec(n=11)和输入电阻(327±2) MΩ(n=11)较I型神经元的显著增大( P<0.05);在检测中11/31个细胞属于此类。3)Ⅲ型神经元:Ⅲ型神经元静息电位也有自发放电,膜时间常数(25±2)msec(n=17)和输入电阻(522±28) MΩ(n=17)较I型和Ⅱ型神经元的都显著增大( P<0.05)。在检测中17/31个细胞属于此类。2. CCK-8S对VMH三种类型神经元放电频率的影响Ⅰ型神经元静息电位没有自发放电,0.4μmol/L CCK-8S对其没有作用;但0.4μmol/L CCK-8S可以使Ⅱ型(n=4)和Ⅲ型(n=4)神经元的自发放电频率增加,它们的自发放电频率都从(4±1) Hz增加到(8±1) Hz(P<0.05),而动作电位的幅值没有明显变化。3.CCK-8S调节VMHⅡ型和Ⅲ型神经元自发放电频率的离子通道机制1)电流钳模式下,超极化方波刺激诱发Ⅱ型和Ⅲ型神经元在刺激起始没有出现sag;电压钳模式下,在Ⅱ型和Ⅲ型神经元都没有记录到一个超极化激活的缓慢内向流。VMHⅡ型和Ⅲ型神经元可能不存在Ih电流,神经元的内在起搏性可能也不是由Ih电流调控的,可能存在其它电流。2) VMHⅢ型神经元存在IA电流,其激活阈值在-60 mv到-50 mv之间(n=6)。IA电流的失活具有电压依赖性,半数最大失活阈值在(-65±1) mv。1 mM 4-AP可以完全阻断该电流。Ⅱ型神经元可能不存在IA电流。3) CCK-8S可以显著的减少VMHⅢ型神经元动作电位后超极化的时程和增加其自发放电频率,但对后超极化幅值的影响没有显著性差异;同时CCK-8S可以明显抑制IA电流。对加药前后神经元放电频率增加值和IA电流减少值的相关性分析结果显示二者呈线性相关,相关系数r=0.99。4.CCK调节VMH神经元自发放电频率的受体机制我们用CCK-B受体的激动剂胃泌素模拟CCK-8S对VMH神经元放电频率的作用。结果发现胃泌素同样可以增加其神经元的放电频率,放电频率从(4±1)Hz增加到(7±1)Hz(P<0.05)。主要结论:1.VMH神经元具有多样性的特征。2.CCK-8S对VMH神经元兴奋性的调节具有选择性,并通过提高大多数神经元的兴奋性使饱中枢兴奋抑制食欲。3.CCK-8S对IA电流的调节可能是其调控VMH神经元整体兴奋性的重要机制。4.CCK-8S可能是通过CCK-B受体来调控VMH神经元兴奋性的。5.运脾复方可能是降低了CCK-8S的浓度,通过CCK-B受体的作用减少了CCK-8S对VMH神经元的IA电流的抑制作用,进而选择性地抑制了VMH神经元的整体兴奋性使饱中枢兴奋性降低,从而达到促进摄食的目的。