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植物根系分泌物,即植物根系分泌到其生长基质中的物质,是植物与土壤微环境进行物质、能量和信息交流的重要媒介。植物根系分泌蛋白有可能在调节根际微环境方面起着关键作用。开展对油菜根系分泌蛋白的研究有助于了解植物体对生长环境的调节适应机制。 植物胞间液或间质液,即植物细胞之间的液体,作为细胞原生质体与环境之间沟通的桥梁,对细胞的生长代谢有重要意义。胞间液中的蛋白质,表现出胞间液多种生理生化功能。对植物胞间液中蛋白的解析向植物逆境生理领域提供了新的视角。 本研究以甘蓝型油菜“鼎油杂4号”为实验材料,建立和优化了植物根系分泌物和胞间液蛋白的收集和制备方法,利用以双向电泳和质谱为主要技术的蛋白质组学分析平台,进行油菜根系分泌蛋白和叶片胞间液蛋白相关研究。取得的主要研究结果如下: 1、优化了适用于收集油菜根系分泌物的幼苗无菌水溶液培养及检测体系。在油菜幼苗无菌水溶液培养方法基础上,将培养与无菌检测同时进行,简化了操作步骤,缩短了实验周期,降低了污染率。 2、优化了根系分泌蛋白提取方法。针对根系分泌蛋白含量低、次生化合物较多的特点,改进了三氯醋酸-丙酮蛋白提取方法,引入了月硅酸钠盐作为蛋白沉淀载体,获得了较好的蛋白提取效果。 3、利用以双向电泳和质谱鉴定为核心的蛋白质组学分析平台,对油菜根系分泌蛋白进行蛋白质组学分析。利用双向电泳技术,对根系分泌蛋白进行分离,获得了背景清晰的油菜根系分泌蛋白表达图谱。利用MALDI-TOF-MS/MS技术和生物信息学方法,进行蛋白同源性分析,鉴定出11种蛋白,结合相关蛋白数据库和文献对其生理、生化功能进行查询,表明多数根系分泌蛋白与植物次生代谢或防御相关。 4、初步建立了油菜叶片胞间液的制备方法。基于渗透-离心方法,利用双离心管装置提取油菜叶片胞间液。叶绿素浓度测定实验结果表明:植物胞间液叶绿素浓度低于全叶片中叶绿素浓度的3%。 5、对油菜叶片胞间液蛋白进行双向电泳分离,获得了背景清晰的双向电泳分离图谱。利用图像分析软件对低磷胁迫下油菜叶片胞间液蛋白双向图谱进行比对分析,结果显示与对照组相比上调表达的有5个蛋白点、下调表达的有4个蛋白点。 6、利用MALDI-TOF-MS/MS质谱技术对差异点进行肽指纹图谱分析,结合数据库对相关同源蛋白查询分析,成功鉴定7个蛋白,通过蛋白数据库及相关文献材料查询对这些蛋白与胁迫相关性做了阐述。有研究表明,类萌发素蛋白和天冬氨酸蛋白酶定位于胞间液,并在植物应对多种生物胁迫或非生物胁迫中起重要作用。