生物质能源是化石能源良好的替代品,乙醇作为比较理想的可再生液体燃料备受国内外科学家的亲睐。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为传统乙醇生产主要用菌,选育其高产菌株一直是燃料乙醇生产的关键因素。其中,应用重组DNA和分子改造技术有目的地改变酵母表达调控网络和已有代谢途径,优化细胞代谢机制,构建优良性状工业微生物显得尤为重要。本研究依据酿酒酵母本身高效的同源重组机制,应用过表达和基因敲除技术,增强合成底物代谢利用率,降低或阻遏乙醇分解代谢流,成功构建双基因缺失突变菌株YS2-Δadh2-Δald6和过表达已糖转运蛋白基因hxt1的YS2-Δadh2-Δald6-hxt1突变株。取得以下研究进展:1、以adh2基因缺陷型酿酒酵母YS2-Δadh2为出发菌株,应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建ald6基因敲除组件,转化酿酒酵母YS2-Δadh2进行同源重组,之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中,半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kan~r基因筛选标记,最后,传代丢失质粒pSH65获得双倍体ald6基因缺失突变株YS2-Δadh2-Δald6。发酵试验表明与出发菌株YS2相比,突变株乙酸合成量降低18%,乙醇最高产量提高12.5%。生理特性试验表现为突变株具有很高的遗传稳定性,生长情况不受影响。2、在pSH47质粒的基础上,通过设计分别带有EcoRⅠ酶切位点引物将hxt1 ORF与截短的hxt7启动子融合到CYC1终止子的上游区域。随后将pUG6载体上的Kan~r抗性基因片段连接到pSHG17载体上,构建了整合表达载体pSHGK17。转化酵母突变株YS2-Δadh2-Δald6,经G418抗性筛选、PCR验证得到过表达hxt1基因突变株YS2-Δadh2-Δald6-hxt1。生长方面突变株迟滞期稍长,指数生长中后期菌浓上升较快,其他方面没有显著差异,遗传稳定性高。发酵检测,突变株YS2-Δadh2-Δald6-hxt1与YS2-Δadh2-Δald6和YS2菌株相比,糖代谢加快,发酵周期分别提前了3小时和8小时;乙醇产量较YS2菌株提高了12.65%。