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体细胞克隆效率低下是猪胚胎工程研究中的难题，更是制约克隆猪包括基因修饰克隆猪生产的不利因素，深入了解卵母细胞成熟与植入前胚胎的发育机理是从根本上解决问题的前提条件，有必要建立系统的猪卵母细胞和早期胚胎分子发育学的研究方法。高通量基因筛选技术已经成功应用于卵母细胞和早期胚胎的表达库的研究，且发现了诸多种合子基因激活(ZGA)之前差异表达的基因和以及以往从未研究的新基因，但是对这些特异表达的基因所知还很有限。而在所有的基因功能研究方法中，RNA干扰(RNAi)以其快速，灵活，易于在卵子和早期胚胎中实现等诸多优势成为最强有力的候选者。RNAi是1999年在线虫中发现的一个神秘现象，哺乳动物中发现更晚，但在至今短短9年时间内却凭借无可争辩的技术优势发展成为功能基因研究中最强有力的工具。在猪胚胎工程中应用RNAi技术进行分子发育学研究将为提高猪体外胚胎生产效率提供新的理论基础。本研究以c-mos和Oct-4基因为模型，通过siRNA(short interfering dsRNA)注射方法，应用Real time PCR和荧光激光共聚焦检测技术初步探索建立了有效的猪卵源基因表达库的RNAi研究体系，并对c-mos和Oct-4基因表达规律以及系统发生关系进行了研究。Booth(2001)应用牛去透明带卵母细胞发明了新的核移植方法，可以在更为简易的实验条件下进行核移植操作，为核移植提供了一个新的技术选择，应用此技术已经先后有核移植牛和鼠出生。对去透明卵母细胞的操作方法的细致研究对提高这种新的克隆技术的效率是非常必要的。在进行卵母细胞／早期胚胎的免疫化学染色、蛋白质提取、以及RNA提取诸多研究时，透明带的存在无疑会影响效果。本研究中对透明带去除方法进行摸索，并对无透明带(zona pellucida free，ZPF)卵母细胞电激活电压进行研究，为以上研究提供方法和基础数据。本研究的主要得到以下结论。三种猪卵母细胞透明带去除试剂中蛋白酶K(PK)处理后在存活率和质膜完整状况上好于蛋白酶E(PE)，比酸性台式液(A-TYR)作用效果更为温和，易于操作，是最好的选择。孤雌激活ZPF卵母细胞时选取110V电压为最高激活电压，以20V为电压梯度设110V，90V，70V，50V和30V 5个实验组和一个0V对照组，50V电压下卵裂情况最好，90V电压下囊胚发育情况最好。采用Neighbor-Joining算法对MOS和Oct-4蛋白进行分子进化分析。两种蛋白的分子进化关系都符合物种进化规律，且功能保守。Oct-4同源蛋白在无脊椎和脊椎动物中存在，但在禽类分支中没有发现。Realtime PCR方法检测c-mos基因的mRNA水平变化，发现猪卵母细胞在成熟之前mRNA量持续增加，激活后6h mRNA水平下降到体外培养0h卵母细胞的0.203±0.15倍，直到2-细胞胚胎期仍保持降低趋势。免疫荧光激光共聚焦方法检测猪卵母细胞体外成熟前后MOS表达和分布变化，MOS在GV卵母细胞生发泡中有一定量的表达，生发泡破裂(GVBD)前表达量增加且开始向卵母细胞胞质弥散，成熟培养44h未成熟卵母细胞中的MOS表达量要高于成熟卵母细胞，激活后6h核区MOS明显减少，但仍然有少量MOS分布于胞质中。干扰序列siMOS803，siMOS1171，siMOS1311都能有效敲低c-mos基因mRNA量，分别是同时期对照组mRNA量的0.08±0.03，0.11±0.06和0.20±0.06倍，干扰后虽然没有完全剔除MOS，但MOS量比同期卵母细胞有明显下降，仍可以引发成熟卵母细胞染色体解凝集，MOS残留越少MⅡ期卵母细胞染色质的解凝集就越彻底。Realtime PCR方法检测Oct-4基因mRNA水平变化。猪卵母细胞和早期胚胎持续表达Oct-4基因mRNA，卵裂前卵母细胞中mRNA量逐渐增高，卵裂胚中Oct-4有所降低，之后一直保持低水平状态，囊胚期迅速升高。干扰序列siOct-4 466和siOct-4 850都能有效敲低Oct-4基因mRNA量，是有效干扰序列，siOct-4 850干扰效果好于siOct-4 466。用c-mos基因的两个有效干扰序列siMOS1311和siMOS1171做不同浓度干扰效果对比，共设3个浓度组：0.2nM、0.2uM和200uM，观察1d后的干扰效果。发现siMOS1311序列只有在最高浓度组200uM能有效干扰c-mos基因表达；siMOS1171在0.2nM和200uM能有效干扰c-mos基因表达，而在中间浓度组0.2uM却不能有效干扰，无浓度依赖性关系。干扰序列打靶位点和效率不同，其在细胞内的最低有效作用浓度也不同。向MⅡ卵母细胞中注射siOct-4 850序列，1d时干扰效率达到60％，2d时检测便达到90％左右，3d时干扰效果同2d时没有差别。猪卵母细胞和早期胚胎中的RNAi反应具有时间依赖性。本研究所建立的RNAi体系可以用于研究母源mRNA所控制的猪卵母细胞成熟、MⅡ期阻滞、激活以及合子基因组激活之前的两次卵裂等几个时间窗口内的基因功能。