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目的:本研究基于相关学者们的前期研究发现,旨在通过免疫组织化学双重染色技术及构建膀胱癌组织芯片方法来验证存在于尿路上皮癌中的EMA~-CD44v6~+细胞群具有干细胞特征,并通过流行病学调查,利用统计学方法分析出膀胱癌中的EMA~-CD44v6~+亚群细胞的含量与膀胱癌患者预后的关系。为进一步探索膀胱癌干细胞的特性及其导致肿瘤发生的相关机制,实验将通过膀胱肿瘤的原代组织培养,建立膀胱原代肿瘤细胞系;通过免疫磁珠分选技术,及高通量基因测序技术分析找出与膀胱癌发病相关的关系最为密切的信号通路,差异比对其中差异表达最明显的突变基因,再通过一系列分子生物学技术分析论证该基因在膀胱癌干细胞中的特异性表达,探索其在膀胱癌干细胞中的相关机制,进一步论证膀胱癌的生物学特征及发病机制,从而为膀胱癌干细胞研究提供新的靶向基因,为临床诊疗提供新的理论依据。方法:收集并筛选出低级别与高级别尿路上皮癌病例各15例,分别进行EMA,CD44v6两种抗体的IHC单独染色标记及IHC双重染色标记。探索不同染色方法,观察双重染色效果,选择最佳双重染色方法,并进行流行病学统计分析探索标本中EMA~-CD44v6~+细胞的含量与不同级别膀胱癌患者预后存在一定联系;收集并筛选50例低级别(pTa期)尿路上皮癌、50例高级别(pT2期)尿路上皮癌及20例正常膀胱粘膜组织的标本,将选择的120例病例蜡块制成组织芯片,进行EMA,CD44v6两种抗体的免疫组织化学双重染色标记。估算每个标本中EMA~-CD44v6~+细胞的含量;流行病学统计了解病患的预后状况,复发时间,死亡时间等临床资料;利用卡方检验和两样本均数t检验方法,统计分析患者肿物中膀胱癌干细胞的含量(即EMA~-CD44v6~+细胞的含量)与其预后状况的关系。将膀胱肿瘤组织块利用消化细胞培养法和组织块培养法进行肿瘤细胞的原代培养,利用贴壁时间差异特征方法去除成纤维细胞杂质,观察肿瘤细胞生长情况。利用免疫磁珠分选技术,分选出膀胱原代细胞中EMA~-CD44v6~+细胞群,一部分继续培养,一部分提取RNA,进行高通量基因测序,进行后续相关机制研究。结果:1.研究发现EMA+细胞一般是位于接近上皮腔面,且细胞相对较成熟的位置,EMA-细胞位于接近上皮基底部并逐渐向上迁移;CD44v6与EMA表达相反,CD44v6+细胞多位于基底部,而CD44v6-细胞则靠近上皮腔面。而膀胱癌CSC可能出现的位置为基底部细胞层,即EMA~-CD44v6~+所在部位。2.EMA与CD44v6抗体免疫组化阳性结果部位均为细胞膜/浆,EMA在膀胱低、高级别尿路上皮癌中的表达率约为90%、95.5%,在正常膀胱上皮粘膜中均表达;CD44v6在膀胱低、高级别尿路上皮癌中的表达率约为78%、36%,在正常膀胱上皮粘膜中几乎不表达,约为5%。探索多种双重染色方法发现,采用DAB联合AEC显色标记及AEC联合NBT/BCIP显色标记方法效果最佳。3.统计学分析发现,膀胱癌组织中EMA阳性表达率与肿瘤的分期、分级无统计学意义(p>0.05),而CD44v6的阳性率随着膀胱肿瘤的分期分级增加呈负相关(p<0.05)。在各分期膀胱尿路上皮癌的免疫组化双染结果中EMA~-CD44v6~+细胞的含量与不同级别膀胱癌患者的预后存在一定联系:随着膀胱尿路上皮癌病理分级、分期的增长,EMA~-CD44v6~+膀胱肿瘤干细胞的含量减低(p<0.05);发生肿瘤复发、转移及死亡的患者较未发生患者其EMA~-CD44v6~+膀胱肿瘤干细胞的含量低,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.与组织块培养法相比,利用消化细胞培养法进行膀胱尿路上皮癌细胞的原代培养更为合适,肿瘤细胞更易贴壁,成长速度较快,细胞的生长模式像上皮样细胞一般。结论:1.根据实验所得结论进行分析,通过免疫组化方法,EMA~-CD44v6~+所呈现的结果猜测,它们是膀胱肿瘤干细胞的生物学标记物可能性很大。2.采用免疫组化双重染色技术能直观、便捷的反映出膀胱尿路上皮癌中肿瘤干细胞的存在部位及含量。3.EMA~-CD44v6~+细胞的含量随膀胱尿路上皮癌的分期、分级的增高而减少,其含量与膀胱肿瘤的复发、转移及死亡存在差异,因此EMA~-CD44v6~+膀胱肿瘤干细胞群含量能够间接反应膀胱肿瘤患者的预后状况。4.消化细胞培养法进行膀胱肿瘤细胞原代培养的方法更好,得到的肿瘤细胞更纯粹,对后期实验提供有利基础。