研究背景各种原因造成的牙齿缺失是人类的常见疾病,对患者的咀嚼、发音、美观甚至心理健康都等有显著影响。而目前,针对牙齿缺失的修复方法有很多,但最接近真牙,经久耐用的方法却较少。种植牙作为修复牙齿缺失一种良好的方法,可以与牙槽骨较好的结合(骨结合),但种植牙缺乏一种重要的天然牙根结构,即牙周组织[1]。因此,牙齿再生已成为国际口腔医学研究的热点。然而,要再生一个完整的牙,需要突破很多科学难点,解决很多再生医学共同的难题[2-4]。近几年有学者提出生物牙根的概念,即利用组织工程方法,用自然界存在的或人工合成的、且具有一定空间结构的、有良好生物相容性的材料为载体,将一些具有成牙能力的细胞以特定方式“种植”到这种载体支架上,然后提供这些细胞增殖、生长和分化所需要的的生长因子微环境。通过细胞相互间的黏附、生长、增殖和分化,在体外或体内形成具有一定牙周韧带结构的牙根[3]。单纯的牙根构建不涉及调控牙冠的形态和大小,在牙齿组织工程研究中具有独特的优势,如果能再生出一个具有牙周韧带结构的生物牙根,并在其基础上进行桩冠修复,将有望成为一种理想的修复牙缺失的再生医学治疗方法[3-5]。这种具有生物活性的且有一定天然牙根结构的组织工程牙根有很大可能取代目前临床上使用的种植义齿修复术。牙根再生是全牙再生的关键科学问题,牙根再生的实现对于临床应用具有重要的意义,可为牙冠构建或全牙构建提供新的研究策略。种子细胞、支架材料和诱导微环境是生物牙根构建的核心部分[6]。目前,已有学者利用组织工程技术,使用牙源性间充质干细胞和生物支架材料在体内或者体外成功的构建了具有牙周膜、牙骨质和牙槽骨的生物牙根[7]。然而,在此构建中应用的种子细胞均为牙源性干细胞[8-9]。虽然牙源性间充质干细胞具有良好的成牙分化能力,但实际临床上该类细胞仅能通过拔除正常牙齿才能获得,且获得的数量有限,因此在临床上获取患者自体牙源性间充质干细胞受到一定限制[4]。例如,对于无牙颌病人及全口牙缺失或者不愿拔出牙齿的患者,如何获取到这些牙源性细胞,是一个有可能阻碍今后牙根再生在临床上应用的问题。在牙源性干细胞来源受到限制的情况下,探索利用人体中已成功分离出的具有转分化能力的多种成体干细胞进行牙齿再生成为必然的选择。如何诱导非牙源性干细胞牙向分化,建立效果明确且稳定的诱导体系,是解决牙齿再生细胞来源问题的关键。来源于骨髓的间充质细胞(英文全称为Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,简称BMMSCs)是一种具有较强增殖能力和多向诱导分化潜能的细胞,大量研究表明BMMSCs已被广泛应用于骨组织工程。除此之外,BMMSC具有分化成其他组织甚至其他胚层细胞的可塑性,而且BMMSCs易于获取,可以从患者自身获得,避免了免疫排斥的问题[10]。人牙本质基质材料(英文全称为human Treated Dentin Matrix,简称h TDM)已有研究证明是理想的牙组织工程的支架材料,人牙本质基质材料本身是一种细胞外基质,对细胞没有毒性,并且具有良好的生物学性能。同时h TDM含有利于成牙的生长因子,这样为细胞的生长提供了一个良好的微环境,本研究在以上研究的基础上,通过h TDM复合BMMSCs的体外及体内实验,探究其BMMSCs的成牙能力。为组织工程方法实现牙根再生的研究提供依据。目的在以上研究的基础,本实验利用改良的处理方法处理离体牙,从而得到新型人牙本质基质生物支架材料;在体外探究人牙本质基质材料对人骨髓间充质干细胞生长、增值分化等生物学特性的影响,并且通过体内、体外实验探究人骨髓间充质干细胞在人牙本质基质生物支架材料作用下,是否能够进行成牙方面的分化。为以后的牙根再生的研究及临床应用奠定基础。材料和方法1.本实验用骨髓从临床进行正颌外科手术修复颌面部畸形的患者取得,经过患者同意后,于术中切取患者上下颌骨时收集剩余的骨组织。采用组织块培养的方法,进行骨髓间充质干细胞的分离培养。2.本研究通过改良的梯度脱矿方法对人牙本质基质进行处理后得到的TDM,扫描电镜下牙本质小管充分暴露,并且管间和管周牙本质纤维组织变的十分疏松。3.通过流式细胞术的方法对对本实验细胞表面分子进行鉴定。4.利用细胞免疫组化的方法对本实验的细胞进行来源鉴定。5.通过成脂、成骨实验,探究本实验获取的骨髓间充质干细胞的分化能力6.光镜观察TDM于骨髓间充后生物学特征的改变。7.采用real time PCR检测经过h TDM浸提液诱导之后的骨髓间充质干细胞的成牙基因的表达的情况。8.h TDM复合BMMSCs移植到裸鼠皮下,体内实验探究TDM探究BMMSCs的成牙能力结果1采用组织块培养法将颌骨剪碎的骨块接种培养瓶,96h后首次换液,一周后光学显微镜下可见颌骨组织块周围有细胞长出,绝大部分为梭形、多边形。然后细胞逐渐增多。传代后细胞的形态变得更加多样化。2将收到的新鲜的离体牙制作与牙根相似外形的TDM,材料约有1mm厚,表面形态十分光滑而且规则。电镜下可见牙本质小管充分暴露,并且管间和管周牙本质纤维组织变的十分疏松。3培养细胞制作细胞爬片,固定后采用Vimentin、CK14进行免疫组化染色,确定细胞来源。Vimentin染色成阳性、CK14染色成阴性4网,流式细胞仪上机,进行细胞表面CD分子检测。检测指标包括:CD105、D31、CD34、CD90、CD73、CD25、CD26、CD146、CD8b等。5人骨髓间充质干细胞的成脂、成骨实验表明人骨髓间充质干细胞有较强的成脂成骨能力。6经过h TDM作用人骨髓间充质干细胞后,TDM有利于细胞的生长,发现细胞数目增加,细胞在材料表面有良好的附着。7采用real-time PCR定量检测TDM的浸提液诱导h BMSCs3、7天后,h BMSCs的成牙相关基因表达明显增加。8 h TDM复合BMMSCs移植到裸鼠皮下2个月后,发现TDM表面出现新生的牙本质。结论1.采用组织块培养法能够分离得到人骨髓间充质干细胞。2.骨髓间充质干细胞来源于不表达上皮源性相关蛋白,表达间充质细胞来源的相关标志,并且表达干细胞特性。3.h TDM能够促进h BMSCs的牙向分化。