FGFR2属于四个成纤维细胞生长因子受体(FGFR1-4)家族中的一员,通过与FGF配体结合发挥其生物学功能。既往研究显示FGFR2可以影响骨骼发育,导致包括Apert、Crouzon、Pfeiffer等在内的多种颅缝早闭综合征(craniosynostoses)。两种FGFR2功能增强(gain-of-function)型点突变(S252W和P253R)可以导致Apert综合征,主要表现为身材短小,冠状缝早闭,头颅圆钝缩短和颅面畸形。目前关于Apert综合征的发病机制仍不完全清楚,且仍缺乏有效缓解颅骨畸形的治疗药物,只能靠手术部分缓解症状。探索Apert综合征发病分子、细胞机制,可望为临床上综合应用相关靶向生物技术、手术等措施治疗Apert综合征提供初步实验依据。颅缝间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)是新近研究发现的,存在于颅缝间充质中的一类具有多向分化潜能的细胞。在小鼠颅缝中条件性剔除颅缝MSCs,可导致小鼠头颅生长阻滞和颅缝早闭。同时在Twist1基因半缺失(Twist1+/-)导致的小鼠颅缝早闭模型中,其颅缝MSCs明显减少。最近研究显示由Recql4基因突变导致的小鼠早衰模型中,其颅骨发育畸形,出现颅缝早闭表型。这些研究提示颅缝MSCs衰老可能是FGFR2导致Apert综合征颅缝早闭的原因,但具体机制不清楚。自噬在干细胞自我更新中发挥重要作用,自噬降低可引起干细胞衰老。FGFs/FGFRs在自噬调控中发挥重要作用。在小鼠MEF及心脏干细胞中,FGFR信号通过FRS2α引起PI3K/AKT信号通路激活的激活,导致mTOR的激活,进而抑制自噬的活性。我们前期研究发现FGFs/FGFR3信号通路负调控自噬水平,在软骨发育中发挥重要作用。FGFR2与FGFR3具有高度同源性,提示FGFR2也可能对自噬具有调节作用,但具体机制不清楚。为了研究自噬和颅缝MSCs衰老在Apert综合征发病中的作用,我们基于Cre-Loxp系统建立了Apert小鼠和敲除p16基因的Apert小鼠,综合应用骨骼组织病理和原代细胞培养等对比观察Apert小鼠和p16敲除Apert小鼠头颅畸形、颅缝早闭、衰老表型及颅缝MSCs的自噬、衰老情况,并深入研究FGFR2对自噬和衰老的调控作用,以及自噬和干细胞衰老在Apert发生中的作用。FGFR2在成骨细胞分化和骨形成中发挥重要作用。但是FGFR2在成年期骨形成和骨重塑中的作用未见报道。既往研究报道FGFR2基因多态性与中国汉族人口的股骨颈骨密度相关,同时Fgfr2突变引起的人类骨骼遗传病的病人中,其四肢骨和颅骨有骨化异常表型。这些研究提示FGFR2参与了成年期骨形成和骨重塑过程,但具体机制不清。BMX模型是目前比较公认的一种研究骨再生(regeneration)和骨重塑(remodeling)的模型,被广泛应用于研究相关基因或生长因子在骨再生和骨重塑中的作用和功能。所以在第二部分实验中,我们建立了成年期可诱导增强FGFR2-P253R的小鼠,通过BMX模型,研究FGFR2功能增强对骨形成和骨重塑的影响,并探讨相关机制。FGFs/FGFRs在关节软骨细胞稳态维持及关节炎发生发展中发挥重要作用。既往我们实验室发现在成年期软骨细胞条件敲除Fgfr1后,通过降低MMP13表达,缓解了小鼠老年性及DMM手术诱导的骨性关节炎进展。这些结果提示FGFR1可能是治疗关节软骨退变的新靶点,通过药物靶向性的抑制FGFR1可以抑制软骨基质降解,延缓关节炎进展。所以在第三部分实验中,我们研究了一种新的FGFR1特异性抑制剂G141,对由FGF-2或IL-1β引起的人类关节软骨细胞或组织块关节退变中的作用和对小鼠因内侧半月板不稳定(DMM)导致的关节软骨退变的影响。研究方法第一部分:FGFR2在Apert综合征发病中的作用与机制研究1.建立Apert小鼠模型,测量小鼠的体重和体长,利用X线摄片、Micro-CT观察小鼠大体表型和骨骼变化,通过H&E染色观察Apert小鼠皮肤表型,通过western blot观察小鼠肝、肾和骨组织中p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平变化;2.利用衰老相关β-半乳糖苷酶染色观察颅缝MSCs衰老阳性细胞数,利用标记保留细胞(Label Retaining Cells)方法,通过EdU长时程标记观察颅缝MSCs细胞数目,利用TUNEL染色观察颅缝MSCs凋亡情况,分离Apert小鼠颅缝MSCs,观察其克隆形成能力、增殖能力、衰老状态及p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平表达变化;3.建立p16-/-;Fgfr2P253R/+双突变小鼠模型,通过X线摄片和阿尔新蓝茜素红全骨架染色观察,小鼠大体表型变化,通话HE染色观察颅缝早闭情况;4.建立可反映Apert小鼠自噬状态的GFP-LC3;Apert小鼠,组织切片观察颅缝MSCs自噬变化;分离小鼠颅缝间充质细胞,Western blot观察LC3水平变化;5.通过自噬激动剂雷帕霉素处理小鼠颅缝MSCs,通过衰老相关β-gal染色、免疫荧光、western blot和增殖克隆形成实验等观察自噬激活对颅缝MSCs衰老状态的影响;6.利用LysoTracker、MitoTracker和CellROX染料观察Apert小鼠颅缝MSCs中线粒体、溶酶体和ROS水平变化及雷帕霉素和NAC处理后对颅缝MSCs ROS水平和衰老的影响。第二部分:FGFR2在BMX后骨形成中的作用与机制研究1.建立成年期可诱导增强FGFR2小鼠,制作BMX模型;2.通过Micro-CT和硬组织切片von kossa染色定量观察BMX后1周、2周和3周股骨和胫骨骨髓腔中骨形成情况;3.利用H&E染色和组织形态计量统计BMX后1周、2周和3周新生骨组织中成骨细胞数目变化,同时利用定量PCR检测BMX后1周、2周和3周新生骨组织中成骨分化相关基因Runx2、Col I、Alp、OP和OC的mRNA水平变化;4.利用TRAP染色和组织形态计量观察BMX后1周、2周和3周新生骨组织中破骨细胞表面积变化,同时利用定量PCR检测BMX后1周、2周和3周新生骨组织Rankl、Opg、M-Csf及Rankl/Opg的比值变化;5.利用EdU标记观察BMX后4天间充质细胞和BMX后1周成骨细胞增殖情况,采用免疫组化观察BMX后一周Runx2和OC的表达水平变化;6.利用免疫组化和western blot检测BMX后一周新生骨组织中β-catenin水平变化,同时利用PCR检测BMX后1周新生骨组织中Wnt/β-catenin下游靶基因Tcf1、Lef1、CyclinD1和CD44的mRNA水平变化;7.采用Wnt/β-catenin信号阻断剂XAV939腹腔注射BMX后小鼠,通过免疫组化观察BMX后一周新生骨组织中β-catenin水平变化,通过Micro-CT观察股骨骨髓腔中新生骨组织变化,通过H&E和TRAP染色和组织形态计量观察成骨细胞数量和破骨细胞表面积变化。第三部分:一种新的FGFR1抑制剂对关节炎的治疗作用研究1.采用激酶抑制实验检测G141对FGFR1、VEGFR2、PDGFRβ、FGFR2和FGFR3的抑制作用,确定其半抑制浓度(IC50),采用caliper mobility shift assay检测G141与ATP的竞争性关系;2.分离人类原代关节软骨细胞,采用FGF-2和G141处理后,通过western blot检测MMP13和ADAMTS5的蛋白表达变化,通过定量PCR检测Mmp13、Adamts5、Type II collagen和Aggrecan的mRNA表达水平变化;3.采用IL-1β和G141处理人类原代关节软骨细胞后,通过定量PCR检测Mmp13、Adamts5、Type II collagen和Aggrecan的mRNA表达水平变化,通过western blot检测MMP13和JNK、ERK1/2和p38 MAPK信号通路变化;4.体外培养人类股骨头软骨组织块,加入FGF-2和或G141共培养14天,蔵红固绿染色检测软骨基质丢失情况,DMMB试验检测GAG释放情况;5.建立小鼠内侧半月板不稳定(DMM)关节炎模型,通过关节腔局部注射G141,采用蔵红固绿染色和OARSI评分方法,观察DMM术后4周和8周关节软骨损伤情况;6.采用免疫组织化学方法检测DMM术后8周关节软骨细胞MMP-13、Collagen type X和Cleaved caspase-3表达变化,通过TUNEL试验检测DMM术后8周关节软骨细胞凋亡情况。实验结果:第一部分:FGFR2功能增强突变通过降低自噬引起干细胞衰老导致Apert综合征的发生1.Apert小鼠表现为早衰表型:身长体重减少,骨质疏松,皮肤变薄,肾脏组织中衰老相关β-gal阳性细胞增加,DNA损伤识别因子γH2AX及周期蛋白依赖性激酶抑制物p53、p16和p21表达升高;2.Apert小鼠颅缝间充质干细胞衰老、减少:颅缝间充质中EdU长时程标记细胞减少,β-gal阳性细胞增多,颅缝间充质细胞增殖减慢,凋亡增加,克隆形成能力降低;3.X线摄片结果显示Apert;p16+/-小鼠其身长较Apert小鼠明显增加,头颅圆钝表型明显缓解。阿尔新蓝-茜素红全骨架染色显示Apert;p16+/-小鼠其头颅较Apert小鼠变长,冠状缝重叠明显缓解,同时颅底变长,颅底软骨连接早闭现象较Apert小鼠稍有缓解;4.与LC3-GFP小鼠相比,Apert;LC3-GFP小鼠其颅缝间充质细胞中LC3聚集明显减少;Apert小鼠颅缝间充质细胞中LC3水平明显降低;5.雷帕霉素处理后Apert颅缝间充质细胞增殖加快、克隆形成能力增加,衰老相关β-gal阳性细胞减少,γH2AX、53BP1的聚集减少和p53和p21的表达降低;6.Apert小鼠颅缝间充质细胞线粒体和溶酶体堆积,线粒体功能障碍和ROS增加,雷帕霉素处理可以明显改善Apert小鼠线粒体功能障碍和降低ROS水平;7.NAC处理后Apert小鼠颅缝间充质细胞中ROS水平明显降低,同时颅缝间充质细胞增殖加快、克隆形成能力增加,细胞核中γH2AX、53BP1的聚集减少;8.FGFR2通过与ATG12-ATG5复合物相互作用后,降低了ATG12-ATG5复合物水平,引起自噬降低。第二部分:FGFR2功能增强突变小鼠BMX后骨形成增加,骨吸收过程延迟和骨吸收减少,Wnt/β-catenin信号通路可能参与了这个过程1.Micro-CT和von kossa染色显示FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周、2周和3周骨髓腔中骨形成增加;2.H&E染色和组织形态计量结果显示FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周、2周和3周新生骨组织中成骨细胞数目增加,定量PCR结果显示FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周、2周和3周新生骨组织中成骨分化相关基因Runx2、Alp、Col I、Opn和Ocn mRNA表达水平升高;3.TRAP染色和和组织形态计量结果显示野生小鼠破骨细胞表面积在BMX后1周达到高峰,随着骨组织逐渐吸收,破骨细胞表面积在2周和3周逐渐减少。而在FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周破骨细胞活性较低,在BMX后2周达到高峰,而在BMX后第3周又明显较野生小鼠降低。FGFR2功能增强突变小鼠BMX后2周破骨细胞吸收高峰较野生突变小鼠BMX后1W破骨细胞吸收高峰明显降低;4.EdU染色显示BMX后4天FGFR2功能增强突变小鼠骨髓腔中间充质细胞增殖明显加快和BMX后7天FGFR2功能增强突变小鼠新生骨组织中成骨细胞增殖明显加快,免疫组化结果显示BMX后7天FGFR2功能增强突变小鼠新生骨组织中Runx2和OC阳性成骨细胞明显增加;定量PCR结果显示FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周、2周和3周新生骨组织中Rankl、Opg mRNA水平明显升高,而Rankl/Opg比值在BMX1周降低,在BMX后2周升高;5.免疫组化和western blot结果显示FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周新生骨组织中β-catenin水平升高,定量PCR结果显示FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周新生骨组织中Wnt/β-catenin下游靶基因Tcf1、Lef1、CyclinD1和CD44的mRNA水平明显升高;6.免疫组化结果显示XAV939处理可以明显降低FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周新生骨组织中β-catenin水平,Micro-CT结果显示XAV939处理可以明显降低FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周新生骨组织的形成,H&E和TRAP染色和组织形态计量结果显示XAV939处理可以明显降低FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周新生骨组织成骨细胞数量和明显升高FGFR2功能增强突变小鼠BMX后1周新生骨组织中破骨细胞表面积。第三部分:关节腔内局部注射FGFR1抑制剂G141可以延缓DMM诱导的小鼠关节软骨退变1.激酶活性抑制实验显示G141对FGFR1有较高的结合力和抑制性,其半抑制浓度(IC50)为2.7±0.54μM,同时G141对FGFR1激酶活性的抑制不依赖于ATP浓度;2.Western blot结果显示G141处理可以明显减少由FGF-2处理引起的p-ERK1/2、MMP-13和ADAMTS-5蛋白水平升高,定量PCR结果显示G141处理可以明显缓解FGF-2处理导致的Mmp-13、Adamts-5升高和Type II collagen、Aggrecan降低;3.Western blot结果显示G141处理可以明显减少由IL-1β处理引起的MMP13蛋白水平升高和JNK、ERK1/2和p38 MAPK信号通路的激活,定量PCR结果显示G141处理可以明显缓解IL-1β处理导致的Mmp-13、Adamts-5升高和Type II collagen、Aggrecan降低;4.藏红固绿染色显示G141处理后能显著缓解FGF-2处理导致的软骨细胞外基质丢失,DMMB实验结果显示G141处理后能显著缓解FGF-2处理导致的软骨细胞外基质GAG的释放;5.藏红固绿染色和OARSI评分显示关节腔局部注射G141可以明显缓解DMM手术导致的小鼠关节软骨退变;6.免疫组织化学结果显示关节腔内注射G141能明显降低DMM手术引起的小鼠关节软骨细胞MMP-13、Collagen type X和Cleaved caspase-3的表达,TUNEL染色显示G141能明显降低DMM手术引起的小鼠关节软骨细胞凋亡。结论:一、FGFR2功能增强突变通过降低自噬,导致线粒体功能障碍、ROS增加,引起颅缝MSCs衰老,导致Apert综合征的发生,采用自噬激动剂雷帕霉素和抗氧化剂NAC处理Apert小鼠颅缝MSCs可以明显缓解其衰老表型;二、成年期小鼠FGFR2功能增强突变可通过上调Wnt/β-catenin信号通路引起BMX后骨形成增加;三、关节腔内局部注射G141可以保护DMM引起的小鼠关节软骨退变。