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肌酸酶(creatinase;EC 3.5.3.3;简称CRE)是一种水解酶,能催化其底物肌酸水解产生肌氨酸和尿素,是肌酐代谢中的关键酶。CRE是一种诊断用酶,主要用于检测血清和尿液中肌酐含量进而评价肾脏功能。本研究主要涉及CRE在E.coli中的异源表达,CRE的表面化学修饰,以及利用生物信息学软件分析CRE的结构,设计亚基间二硫键,以期高酶的稳定性。(1)优化cre基因序列,异源表达及酶学性质研究。对Pseudomonas putida来源的cre基因与表达宿主E.coli的密码子偏好性进行分析,发现两者使用频率存在明显差异,然后对cre基因进行密码子优化合成。优化后的cre基因在E.coli中获得了可溶性表达,质谱分析表明重组CRE是以同源二聚体形式存在,与出发菌株一致。CRE经纯化后进行酶学性质及PAGE分析,并确定Tm值。(2)利用多聚赖氨酸(poly-lysine)对双亚基CRE表面进行化学修饰,高了酶的p H稳定性。通过对CRE表面酸碱氨基酸分析,选择具有多个结合位点的长链poly-lysine为修饰剂,优化修饰条件后,获得稳定性高的修饰酶。与修饰前的CRE相比,修饰后酶的Tm值高了2.07℃;当pH值为4.0和10.0时,修饰后酶的活力仍然大于50%,而无修饰酶的活性几乎丧失。(3)通过定点突变技术在CRE亚基间构建二硫键,酶的稳定性得到了高。根据CRE的三维结构特点,采用Disulfide by Design软件分析预测可能形成亚基间二硫键的位点,结合定点突变技术,获得了一个稳定性高的突变体H125C-L130C。通过变性非还原电泳证实了突变体亚基间二硫键的形成,软件模拟及圆二色谱分析发现突变体的三维结构没有发生较大变化,突变体H125C-L130C的Tm值较突变前相比高了3.80℃,说明亚基间二硫键形成后,对CRE稳定性起到促进作用。