论文部分内容阅读
登革病毒(Denguevirus，DV)是黄病毒科的单股正链RNA病毒，有4种血清型，均可以引起登革热(Classicaldenguefever，DF)和登革出血热/登革休克综合征(Denguehemorrhagicfever/Dengueshocksyndrome，DHF/DSS)，广泛流行于热带和亚热带地区。每年DF病例超过1亿，DHF病例约50万。WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病。但DV的发病机理不明，临床治疗也主要是支持对症为主。
目前，关于DHF/DSS发病机制的看法主要有三种：①抗体依赖增强(Antibody-dependentenhancement，ADE)理论：认为DV特异性IgG所引起的免疫增强效应导致出现DHF/DSS的病理变化；②病毒因素致病理论：认为病毒毒力或复制能力等因素是导致严重疾病的原因；③免疫病理反应理论：认为交叉反应性T细胞介导的细胞免疫损伤是DHF/DSS的主要病理机制。有人甚至认为，高病毒滴度、再次感染和DV2是发生DHF/DSS的三个主要因素。而疫苗研究重点集中在研制四价疫苗，希望能同时抵抗四型DV的感染，减毒四价活疫苗曾一度被认为是最具前景的候选疫苗。但迄今为止，仍然没有获得既安全又有效的疫苗。
基于近年来DHF/DSS患者数明显增加和临床上无有效防治手段的现状，被动免疫或者说是治疗性抗体策略引起了研究者的关注。这种方法早在19世纪末就已经发现并应用，在20世纪30年代被广泛使用，但由于当时的抗体制备水平有限和免疫知识背景的缺乏，这一方法在40年代被禁止。近年来，抗体技术在制备、纯化或人源化等方面均取得了较大的进步，被动免疫治疗或者治疗性抗体的策略再次成为焦点。大量的体外和体内实验均已证明：抗体尤其是中和抗体能有效阻止病毒感染宿主细胞。所以，无论从研究DV病理机制角度，还是从研发疫苗角度，获得高质量的特异性抗体具有重要意义。
本试验以传统方法制备登革病毒2型(Denguevirustype2，DV2)Tr1751株的小鼠单克隆抗体(Monoclonalantibodies，mAb)，并鉴定其特性，期望能获得多株抗DV的mAb，为后续研究DV的致病机理，以及疫苗的研发提供初步的免疫学工具。
本研究主要结果与结论如下：1.获得了三株分泌DV特异性mAb的杂交瘤细胞株：本实验以含高滴度DV2的Blab/c乳鼠脑匀浆为免疫原，按步骤多次免疫Blab/c小鼠。用PEG4000将免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞进行融合，再采用HAT培养液筛选，存活的杂交瘤细胞进行克隆化培养，通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)确定阳性株。之后反复采用细胞记数稀释法和ELISA进行筛选，直至阳性率为100％，从而获得分泌DV特异性mAb的杂交瘤细胞系。各经5次克隆化后，获得了3株稳定分泌mAb的杂交瘤细胞系，分别命名为B152、I1、I9。
2.间接免疫荧光染色证实mAb的特异性：本实验针对三株mAb分别设置了一般感染组和正常对照组，即分别将感染和未感染DV2的ECV304细胞固定在玻片上进行染色。以腹水mAb为一抗，羊抗小鼠IgG-FITC为二抗，荧光显微镜观察结果。一般感染组中病毒抗原被强染，病毒抗原多集中在细胞质的一侧，呈“火焰”状、“流星”状，还有分布于核周的病毒抗原有时也被强染。而正常对照组中，均无特异性染色出现。阳性对照(小鼠抗DV2血清为一抗)的一般感染组中强染的病毒抗原在形态和分布上都与mAb相似，但荧光亮度更强，进一步确证了mAb的特异性。
另外，在腹水mAbB152染色中还发现，除分布于核周的病毒抗原外，还有病毒以外的细胞成分被强染，阳性反应呈线性和网状分布于细胞胞浆区，类似细胞的微丝骨架，而且在未感染DV2的细胞中也发现了线性和网状的微丝样着色。利用mAbB152和Phallodin-TRITC(特异性显示微丝)进行双染色，发现病毒感染后出现的环状微丝可同时被mAbB152强染。所以，该株抗体可能既识别病毒抗原，也识别细胞骨架的微丝成分。
3.PRNT证明mAb具有中和特性：将VERO细胞接种于24孔板，生长至单层。将已测定滴度为9×105PFU/ml的DV2稀释到约90PFU/0.1ml。设腹水单抗组和正常小鼠血清组进行噬斑减少分析，每组按1：10、1：40、1：100、1：160、1：640的比例分别稀释。取稀释的病毒液0.5ml和各稀释度的腹水单抗或正常小鼠血清0.5ml混匀，37℃水浴1h，感染培养于24孔板的VERO细胞，约7～8d后结晶紫染色计数PFU发现：阳性对照孔的平均PFU为90；阴性对照孔PFU均为0；加腹水单抗组PFU均有不同程度的减少，并且随抗体浓度增加而明显；正常鼠血清对照组在1：10浓度时，也对PFU有较大的影响。但在1：40及其以上稀释度时，对PFU则无明显影响。说明三株腹水mAb都对DV2有中和作用。计算三株mAb的50％噬斑阻断浓度(50％plaqueinhibitionconcentration，IC50)：I1在1：160左右，I9在1：100左右，B152在1：40左右。
4.Westernblot证明mAb识别DVE蛋白的抗原表位：本实验设检验组和对照组：检验组为浓缩的DV2样本，对照组为C6/36细胞样本。各样本经SDS-PAGE后，凝胶转印到醋酸纤维膜上。三株腹水mAb分别为一抗，并设小鼠抗DV2血清为阳性对照、不加抗体为二抗本底对照。以HRP标记的羊抗小鼠血清为二抗，DAB显色。(1)不加一抗的检验组和对照组均无显色；(2)小鼠抗血清的检验组有多条显色条带，而对照组无显色；(3)mAb组：对照组无显色，而检验组只有一处显色条带，且3株单抗显色条带粗细不同，显示mAb亲和活性不同，或腹水mAb的滴度不同。氨基黑染色显示Marker条带，发现mAb显色带的相对分子质量(Molecularweightratio，Mr)比66200略小，大于43000，判断是病毒E蛋白区(Mr=55000～60000)。E蛋白是最有可能诱导产生中和抗体的DV结构蛋白，结合PRNT，确认3株mAb为识别E蛋白中和抗体。